杜 浩，冷小茜，張書(shū)環(huán)，葉 歡，沈 麗，劉志剛，陳細(xì)華，危起偉

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430223)

達(dá)氏鱘gdf11基因cDNA的克隆及組織表達(dá)特征分析

杜 浩，冷小茜，張書(shū)環(huán)，葉 歡，沈 麗，劉志剛，陳細(xì)華，危起偉

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430223)

本研究克隆了達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子gdf11(growth differentiation factor 11)基因cDNA。達(dá)氏鱘gdf11基因cDNA序列全長(zhǎng)1 298 bp(不包括Poly A)，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 191 bp，編碼396個(gè)氨基酸，5非編碼區(qū)長(zhǎng)19 bp；3非編碼區(qū)長(zhǎng)88 bp。通過(guò)Signal P軟件預(yù)測(cè)含有N端21aa的信號(hào)肽。組織表達(dá)特征分析結(jié)果顯示，gdf11在7種組織中均有表達(dá)，在眼和鰓中的表達(dá)量較高；不同水流條件下，鰓和心臟gdf11的表達(dá)量有顯著性差異，靜水中鰓gdf11表達(dá)量是流水(流速27.0±3.0 cm/s)的4.70倍，而心臟中的表達(dá)量是流水的2.72倍。這暗示了gdf11可能在呼吸代謝中發(fā)揮功能。

達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)；gdf11基因；基因克??；組織表達(dá)特征

gdf11(growth differentiation factor 11)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族(Transforming Growth Factor β superfamily，TGF-β)成員，被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物中控制中軸骨形成的關(guān)鍵因子。通過(guò)基因敲除，Mcpherron等[1]發(fā)現(xiàn)gdf11在哺乳動(dòng)物前后軸特化的過(guò)程中起著重要作用。Gamer等[2]已經(jīng)證明爪蟾gdf11是軸中胚層和神經(jīng)組織形成的關(guān)鍵誘導(dǎo)信號(hào)。目前，有關(guān)gdf11基因在魚(yú)類(lèi)中的研究較少，但其功能似乎更加多元化。斑馬魚(yú)(Daniorerio)中，gdf11基因在精巢、卵巢、肌肉、腦和鰓中都有表達(dá)，且表達(dá)量相差不大[3]。另外，有研究證明，斑馬魚(yú)gdf11基因在肝臟和胰腺的外分泌過(guò)程中起著重要作用[4]。在金頭鯛(Sparusaurata)中，gdf11基因的表達(dá)較為廣泛，如腦、性腺、眼、脾、腎、鰓絲、腸、皮膚、心臟、肝、肌肉和垂體[5]。

鱘形目魚(yú)類(lèi)是現(xiàn)存起源最早的脊椎動(dòng)物之一。達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)隸屬于鱘形目，為我國(guó)特有物種，主要分布于金沙江下游和長(zhǎng)江上游。目前關(guān)于達(dá)氏鱘的研究主要集中在養(yǎng)殖、繁殖、發(fā)育及行為[6-8]，生態(tài)評(píng)估[9]以及物種鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記[10]方面。對(duì)達(dá)氏鱘功能基因的研究，進(jìn)行了deadend[11]、vasa[12]基因的表達(dá)特征和功能分析。本研究克隆了達(dá)氏鱘gdf11基因cDNA全長(zhǎng)，分析了其與其他脊椎動(dòng)物gdf11的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并研究了gdf11在不同組織中的表達(dá)特征。為進(jìn)一步研究gdf11在脊椎動(dòng)物中的功能機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

實(shí)驗(yàn)魚(yú)取自長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所荊州中華鱘繁育基地人工孵化幼魚(yú)，選用常規(guī)養(yǎng)殖條件(微流水)下2月齡達(dá)氏鱘分別取肝、心、脾、眼、肌肉、鰓和腦，在液氮中速凍，然后存放-80 ℃冰箱。同時(shí)采集人工造流環(huán)境(流速27.0±3.0 cm/s)[8]中同齡達(dá)氏鱘相同組織。

1.2 RNA提取及SMART cDNA合成

各種組織總RNA用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)提取，cDNA合成采用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

取達(dá)氏鱘腦總RNA，按Super SMART? PCR cDNA Synthesis Kit操作手冊(cè)的方法合成達(dá)氏鱘腦SMART cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 達(dá)氏鱘gdf11基因的克隆

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋已知物種的gdf11基因的序列，通過(guò)Clustal X2比對(duì)分析保守區(qū)，然后運(yùn)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)，以合成的達(dá)氏鱘腦SMART cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照peggy等[3]的方法，根據(jù)得到的達(dá)氏鱘gdf11基因擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)上下游特異引物(表1)，以達(dá)氏鱘腦SMART cDNA為模板，分別與RACE引物進(jìn)行5和3RACE 擴(kuò)增，產(chǎn)物用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選陽(yáng)性菌液送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 基因序列特征分析和同源性分析

將所得序列用DNAstar軟件拼接后，得到達(dá)氏鱘gdf11基因的全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析；用ORF Finder進(jìn)行開(kāi)發(fā)閱讀框的查找，并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列；運(yùn)用ExPASy Molecular Biology Server 預(yù)測(cè)信號(hào)肽；DNA和氨基酸序列同源性的比較采用Clustal W軟件。

1.5 達(dá)氏鱘gdf11基因的表達(dá)特征分析

根據(jù)得到的達(dá)氏鱘gdf11基因的序列，設(shè)計(jì)定量PCR引物Adgdf11-qRT-F和Adgdf11-qRT-R，以達(dá)氏鱘β-actin基因作為內(nèi)參，以不同組織的cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，讀板溫度77 ℃，讀板時(shí)間5 s；40次循環(huán)，做熔解曲線(xiàn)分析溫度為65～95 ℃。所有實(shí)驗(yàn)樣品均重復(fù)3次。

表1 達(dá)氏鱘gdf11基因克隆所用引物Tab.1 Sequences of the primers used for gdf11 gene

2 結(jié)果

2.1 達(dá)氏鱘gdf11基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)gdf11基因家族保守的區(qū)域，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以達(dá)氏鱘腦SMART ds cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到了一個(gè)大小為851 bp的片段(圖1)。將該片段克隆測(cè)序后，通過(guò)BLAST進(jìn)行同源搜索，結(jié)果證明為gdf11基因。然后根據(jù)擴(kuò)增片段的序列，設(shè)計(jì)gdf11基因特異引物，通過(guò)3RACE-PCR的方法，獲得了達(dá)氏鱘gdf11基因cDNA序列的3端，共315 bp；通過(guò)5RACE-PCR，獲得了基因cDNA序列的5端，共343 bp(圖2)。通過(guò)序列拼接，得到了達(dá)氏鱘gdf11基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

圖1 達(dá)氏鱘gdf11基因保守片段的克隆Fig.1 Cloning of the conserved fragment of gdf11 gene in A. dabryanus M, DNA Marker DL2000

圖2 達(dá)氏鱘gdf11基因3端和5端cDNA序列的克隆Fig.2 Cloning of the 3 and 5 end sequence of gdf11 gene in A. dabryanus M, DNA Marker DL2000

2.2 達(dá)氏鱘gdf11基因cDNA序列特征

達(dá)氏鱘gdf11基因的cDNA序列全長(zhǎng)1 298 bp(不包括Poly A)，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 191 bp，編碼396個(gè)氨基酸，5非編碼區(qū)長(zhǎng)19 bp；3非編碼區(qū)長(zhǎng)88 bp(圖3)。通過(guò)Signal P軟件預(yù)測(cè)含有N端21aa的信號(hào)肽。

圖3 達(dá)氏鱘gdf11基因全長(zhǎng)cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence of gdf11 in A. dabryanus and its deduced amino acids sequence.下劃線(xiàn)的氨基酸為信號(hào)肽；起始密碼子、終止密碼子和加尾信號(hào)為粗體。

2.3 達(dá)氏鱘gdf11基因的生物信息學(xué)分析

在NCBI和Ensembl上搜索其他物種gdf11的氨基酸序列，通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物的gdf11非常保守，都含有一個(gè)潛在的蛋白水解位點(diǎn)RSPP。另外，還有9 個(gè)非常保守的半胱氨酸殘基(圖4)，而且達(dá)氏鱘gdf11與其他物種該基因編碼的氨基酸序列的一致性較高，依次是腔棘魚(yú)(88%)、青鳉(88%)、金頭鯛(88%)、紅鰭東方鲀(87%)、三刺魚(yú)(87%)、綠河豚(86%)、斑馬魚(yú)(86%)、綠海龜(77%)、人(70%)和小鼠(70%)。

圖4 達(dá)氏鱘及其他物種gdf11基因編碼氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.4 Multiple amino acids alignments of the gdf11黃線(xiàn)處為潛在的蛋白酶水解位點(diǎn)，紅色三角處為半胱氨酸

2.4 達(dá)氏鱘gdf11在不同組織中的表達(dá)特征

為了分析gdf11的組織表達(dá)特異性，我們?nèi)〕Ｒ?guī)養(yǎng)殖條件下達(dá)氏鱘8種不同組織cDNA為模板，分別擴(kuò)增gdf11和β-actin基因進(jìn)行Real-time PCR分析。結(jié)果表明，達(dá)氏鱘gdf11基因在所檢測(cè)組織中均有表達(dá)。其中，在眼和鰓中的表達(dá)量較高，接著依次為腦、肝、肌肉和脾(圖5)。

圖5 達(dá)氏鱘gdf11基因的組織表達(dá)特征Fig.5 Analysis of the expression pattern of gdf11 in A. dabryanus

2.5 靜水和流水作用下達(dá)氏鱘gdf11基因的表達(dá)情況

靜水和流水對(duì)達(dá)氏鱘gdf11基因mRNA表達(dá)的影響如圖6所示。由圖可知，在肌肉、腦和肝中，靜水和流水對(duì)達(dá)氏鱘gdf11基因mRNA的表達(dá)幾乎沒(méi)有影響。然而，在心和鰓中，靜水和流水對(duì)達(dá)氏鱘gdf11基因mRNA的表達(dá)的影響較大。在靜水中，鰓中g(shù)df11基因mRNA的表達(dá)量是流水中的4.70倍，而心臟中g(shù)df11基因mRNA的表達(dá)量是流水中的2.72倍(圖6)。

圖6 靜水和流水養(yǎng)殖組中達(dá)氏鱘gdf11基因mRNA的表達(dá)差異Fig.6 Differential expression of Adgdf11 in static and flowing water C，靜水組；V，流水組。

3 討論

本研究克隆了鱘形目魚(yú)類(lèi)達(dá)氏鱘的gdf11基因cDNA，通過(guò)達(dá)氏鱘gdf11與其他脊椎動(dòng)物gdf11蛋白的氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因十分保守。在N端都含有一個(gè)21aa的信號(hào)肽，同時(shí)都存在著一個(gè)潛在的蛋白水解位點(diǎn)；另外，gdf11蛋白C端的氨基酸序列非常保守，相似性能達(dá)到90%，并且還含有9個(gè)非常保守的半胱氨酸殘基。這些結(jié)果表明，在進(jìn)化過(guò)程中，該基因十分保守。

組織表達(dá)特征分析結(jié)果顯示，gdf11在眼，腦和肌肉均有表達(dá)，這與其他脊椎動(dòng)物的表達(dá)模式類(lèi)似，表明該基因功能上的保守性。此外，我們發(fā)現(xiàn)gdf11在鰓中也有較高的表達(dá)量，為了進(jìn)一步驗(yàn)證達(dá)氏鱘gdf11是否與呼吸代謝功能有關(guān)，我們?cè)O(shè)計(jì)了不同流速的養(yǎng)殖水體，分析達(dá)氏鱘在不同水流條件下gdf11的表達(dá)差異，結(jié)果顯示鰓和心臟gdf11的表達(dá)量出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，靜水中鰓gdf11基因mRNA的表達(dá)量是流水的4.70倍，而心臟中的表達(dá)量是流水的2.72倍。上述結(jié)果暗示達(dá)氏鱘gdf11很可能與心和鰓的呼吸和代謝功能有關(guān)，它們決定著氧氣、能量輸送。前期實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到水流組肌肉有氧代謝酶在流水組中顯著高于靜水組，流水組的靜止耗氧率反而顯著低于靜水阻(杜浩，未發(fā)表數(shù)據(jù))，推斷流水組達(dá)氏鱘心、鰓對(duì)氧氣的輸運(yùn)功能得到加強(qiáng)，從而抑制了gdf11基因的表達(dá)。魚(yú)類(lèi)的心臟和呼吸系統(tǒng)在水流訓(xùn)練情況下功能得到加強(qiáng)已經(jīng)被一些研究證明[13]。大鱗大馬哈魚(yú)在水流訓(xùn)練中心臟指數(shù)如，心搏量增加、心率加快[14]。與之相適應(yīng)的是血液循環(huán)加速、呼吸頻率加快，鰓組織的氣體流通量增加。本研究結(jié)果也可推斷，gdf11基因?qū)τ谛?、鰓功能方面同樣表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控效應(yīng)，流水組gdf11表達(dá)量的降低，促進(jìn)了達(dá)氏鱘能量輸運(yùn)，代謝能力加強(qiáng)，從而使總體的能量消耗多于靜水組。但該方面的具體功能機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Cloning and expression pattern of gdf11 cDNA in Acipenser dabryanus

DU Hao, LENG Xiao-qian, ZHANG Shu-huan, YE Huan, SHEN Li, LIU Zhi-gang, CHEN Xi-hua, WEI Qi-wei

(YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisheryScience，KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation，MinistryofAgriculture，Wuhan430223，China)

The full-length cDNA of thegdf11 (growth differentiation factor 11) gene fromAcipenserdabryanuswas cloned. Thegdf11 gene cDNA is 1 298 bp in size and has a 1 191 bp ORF (open reading frame) encoding a putative protein of 396 amino acid residues, and 5 and 3 non-coding region were 19 bp and 88 bp respectively. By Signal P prediction, it was found thatA.dabryanusgdf11 protein contained a 21 amino acid signal peptide. The RT-qPCR analysis showed thatgdf11 was existed in all the examined tissues, and it was expressed highly in the eyes and gills. Under different flow conditions, significant differences were found in thegdf11 expression level of the gills and heart, the expression ofgdf11 gene in the gill and heart ofA.dabryanusin the static water group is 4.70 times and 2.72 times of those in the flow enriched water group (27.0±3.0 cm/s). These impliedgdf11 might have functions in the respiratory metabolism.

Acipenserdabryanus；gdf11 gene；Gene cloning；Tissue expression pattern

2016-05-19；

2016-09-29

公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)(200903048)；國(guó)家自然基金青年基金項(xiàng)目(31202003)；中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司科技環(huán)保項(xiàng)目

杜 浩(1981- )，男，博士，副研究員，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)闉l危魚(yú)類(lèi)保護(hù)。E-mail: duhao@yfi.ac.cn

危起偉。E-mail: weiqw@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)01-0030-05