沈 清，金仁耀，馮俊麗，薛 靜，陳 康，戴志遠(yuǎn)*

二醇基硅膠固相萃取-多維質(zhì)譜對烏鱧組織脂質(zhì)組學(xué)分析

沈 清，金仁耀，馮俊麗，薛 靜，陳 康，戴志遠(yuǎn)*

（浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012）

建立以二醇基鍵合硅膠（SiO2/diol）為填料的固相萃取（solid-phase extraction，SPE）和基于多維度串聯(lián)質(zhì)譜的鳥槍法分離純化并測定烏鱧肌肉組織中的磷脂。利用Folch法和SPE法提取并純化磷脂，比較3 種不同填料SPE柱的萃取效果，優(yōu)化SPE參數(shù)，最佳條件：上樣量100 μL，淋洗液pH值為2，洗脫液為體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液1 mL。所得提取物以直接進(jìn)樣的方法流動注射入電噴霧離子源，經(jīng)三重四極桿質(zhì)譜的母離子掃描和中性丟失掃描模式，實現(xiàn)對磷脂分子種類的鑒定和定量。同時，通過多維度串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到各個磷脂分子中2 條脂肪酸鏈長度和不飽和度信息。實驗結(jié)果顯示，烏鱧樣品中成功檢出磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸4 類磷脂，共計67 種磷脂分子，且大部分磷脂均含有不飽和脂肪酸鏈。本方法簡單高效，分析準(zhǔn)確快捷，結(jié)果穩(wěn)定。

鳥槍法脂質(zhì)組學(xué)；多維質(zhì)譜；二醇基硅膠；固相萃??；烏鱧

烏鱧俗稱黑魚，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一。其生命力旺盛，繁殖力強，并且味道鮮美，營養(yǎng)價值高，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和人體必需的鈣、磷、鐵及多種維生素[1]。黑魚作為藥用具有祛風(fēng)治疳、補脾益氣、滋補調(diào)養(yǎng)、生肌補血，促進(jìn)傷口愈合等功效[2]。目前國內(nèi)對烏鱧的研究主要停留在分子遺傳學(xué)和養(yǎng)殖技術(shù)，而對烏鱧磷脂成分分析報道則相對較少[3-4]。磷脂對維持代謝，乳化血脂和膽固醇，信號傳遞，提高免疫力等發(fā)揮重大作用[5-6]。脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展極大地促進(jìn)了磷脂的研究[7]。美國、歐洲、日本等都分別建立相關(guān)研究機構(gòu)，如LIPID MAPS[8]、LipidomicNet[9]及LipidBank[10]。中國脂質(zhì)組學(xué)研究起步較晚，通過Web of Science篇名檢索“Lipidomics”僅有論文90余篇，相關(guān)工作集中在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在食品科學(xué)領(lǐng)域相對較少[11-12]。因此，開展烏鱧脂質(zhì)組學(xué)能提高我國脂質(zhì)組學(xué)科研水平，并為烏鱧研究與開發(fā)提供一個嶄新的視角。

目前脂質(zhì)組學(xué)研究方法主要有薄層色譜法和質(zhì)譜法[13-14]，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[15-16]，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜快速掃描法[17-18]。質(zhì)譜技術(shù)是脂質(zhì)組學(xué)研究最核心的手段。鳥槍法是一種基于三重四極桿質(zhì)譜儀，利用磷脂特征官能團(tuán)，通過離子源內(nèi)分離實現(xiàn)對不同樣品脂質(zhì)組學(xué)快速掃描的方法[19]。同時經(jīng)多維度質(zhì)譜掃描可得到磷脂脂肪酸鏈長度與不飽和度信息。盡管鳥槍法樣品無需預(yù)分離即可直接質(zhì)譜進(jìn)樣，脂質(zhì)粗提物中的甘油脂、膽固醇等雜質(zhì)會對磷脂分析靈敏度產(chǎn)生影響。二醇基鍵合硅膠是一種親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）填料，對磷脂具有較好的吸附解吸作用[20]?；诙蓟枘z固相萃取（solidphase extraction，SPE）技術(shù)純化磷脂的研究鮮見報道。

本研究建立二醇基硅膠SPE-多維質(zhì)譜鳥槍法對烏鱧肌肉組織進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析。該方法操作簡單快捷、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠。該方法的建立對于水產(chǎn)品脂質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏鱧 市購；取背部肌肉后切片，備用。

甲醇、乙腈、三氯甲烷（均為色譜純） 德國Merck公司；二醇基鍵合硅膠填料 日本富士公司；磷脂標(biāo)準(zhǔn)品：磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS） 美國Avanti公司；磷脂標(biāo)準(zhǔn)品使用時配制成1 mg/mL母液備用。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源） 美國AB Sciex公司；針泵注射進(jìn)樣器 美國Harvard公司；落地式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 粗脂提取

粗脂提取采用改進(jìn)的Folch法。精密稱定研磨好的烏鱧樣品0.1 g，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）混合液3 mL冰浴超聲提取30 min，加入超純水1 mL并以12 000 r/min高速冷凍離心5 min。使用200 mL移液槍轉(zhuǎn)移下清液，向余下的上清液和固形物中加入2 mL氯仿溶液，重復(fù)提取2 次。合并下清液并用氮氣吹干，加入1 mL甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm有機膜后即得到粗脂質(zhì)的提取物。

1.3.2 SPE條件

選取1 mL SPE柱空管，在底部墊上篩板，然后往柱管中填裝100 mg二醇基鍵合硅膠，在上層用篩板壓平。SPE柱使用前預(yù)先分別用3 mL甲醇溶液、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液、乙腈進(jìn)行活化和平衡。用移液槍取脂質(zhì)粗提物100 μL后上樣，并以0.2 mL/min流速通過柱床。用乙腈清洗SPE柱，棄去淋洗液后用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液1 mL進(jìn)行洗脫，收集洗脫液后用氮氣吹干，并用100 μL乙腈復(fù)溶后準(zhǔn)備質(zhì)譜分析。

1.3.3 質(zhì)譜條件

針泵注射進(jìn)樣器流速為5 μL/min。質(zhì)量掃描范圍m/z 450～950。不同類磷脂在母離子掃描（precursor ion scan，PIS）和中性丟失掃描（neutral loss scan，NLS）2 種模式下檢測，并通過多通道監(jiān)測將譜圖累加。正負(fù)離子模式下離子噴霧電壓分別為5.5 kV和4.5 kV，離子源溫度為450 ℃，霧化氣和氣簾氣壓力分別為35 psi和20 psi，去簇電壓和碰撞電壓分別為100 V和40 V。磷脂分子通過Lipid View 1.1搜索庫鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 二醇基硅膠SPE條件優(yōu)化

圖1 淋洗液pH值（A）與洗脫液體積分?jǐn)?shù)（B）對SPE磷脂萃取效率的影響Fig. 1 Effects of eluent pH (A) and concentration (B) on the extraction efficiency of SPE for phospholipids

SPE不僅能選擇性富集目標(biāo)化合物，同時也能去除樣品中的鹽分，避免造成其對質(zhì)譜實驗結(jié)果的干擾。分別考查影響SPE的3 個主要因素，上樣量、pH值、洗脫液。結(jié)果顯示，100 μL樣品為最佳上樣量，因烏鱧提取物中磷脂含量較豐富，上樣量超過100 μL后容易使回收率降低，結(jié)果不穩(wěn)定；上樣量小于50 μL時，會導(dǎo)致部分低豐度磷脂濃度偏低，不易被質(zhì)譜檢測到。磷脂在SPE柱中保留行為受pH值變化顯著，將淋洗液pH值調(diào)整為2～9五個點進(jìn)行測試，如圖1A所示，隨著淋洗液pH值升高，各磷脂分子與二醇基硅膠作用明顯降低，故選擇pH 2作為SPE淋洗液酸度。如圖1B所示，當(dāng)采用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈溶液時，PC和PE的回收率分別為92%和84%。隨著洗脫液中乙腈體積分?jǐn)?shù)的升高，PC和PE的回收率均出現(xiàn)了下降趨勢，且PC的下降趨勢更為明顯。當(dāng)洗脫液為體積分?jǐn)?shù)90%乙腈溶液時，PC和PE的回收率只有62%和66%。因此，洗脫液采用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈溶液可將磷脂洗脫。

比較3 種不同填料SPE柱（二醇基硅膠、C18、硅膠）的磷脂萃取效率。硅膠是最常用的色譜填料之一，其優(yōu)點是價格低廉，但是硅膠填料吸附能力太強，會對磷脂造成一定死吸附，因此PC和PE的回收率僅為56%和51%；C18填料使用最為廣泛，對絕大部分中等極性和非極性化合物均有較好的保留，吸附化合物較寬泛，PC和PE的回收率均達(dá)到80%以上，缺點是價格相對較高，且雜質(zhì)清除能力無特異性與專一性，故對磷脂的純化作用不明顯；二醇基硅膠填料對磷脂特異性較強，能選擇性吸附混合樣品中的磷脂分子，其對PC和PE的回收率分別為88%和93%。因此，本實驗采用二醇基硅膠-SPE柱分離純化烏鱧粗提物中磷脂。

2.2 鳥槍法脂質(zhì)組學(xué)鑒定

將處理后的樣品直接注入電噴霧離子源，選定特征離子碎片即可通過質(zhì)譜掃描得到所有含有該碎片的母離子。如圖2所示，PC含有特征碎片[C5H15O4NP]＋，故選定m/z 184為子離子，經(jīng)PIS后即可得到所有PC類磷脂（圖2A）。PE含有特征碎片C2H8O4NP，選定中性丟失碎片141 u進(jìn)行NLS，經(jīng)NLS后即可得到所有的PE類磷脂（圖2B）。同理，掃描87 u（C3H5O2N）和m/z 241（[C6H10O5P]－）分別可得到PS和PI類磷脂（圖2C、D）。

圖2 鳥槍法測定烏鱧組織磷脂質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of phospholipids in muscle tissue of Channa argus by shotgun lipidomics

確定磷脂分子種類后，即可對磷脂分子的2 條脂肪酸鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。目前國外常用多維質(zhì)譜法，國內(nèi)鮮有報道[7,21-22]。本實驗采用多維質(zhì)譜法，選定脂肪酸鏈碎片后得到含有該脂肪酸鏈的所有磷脂并與圖2比對。如圖3所示，經(jīng)PIS m/z 283和m/z 303后得到圖3A、B，分別代表所有含有脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)為C18:0和C20:4的磷脂分子。比較后發(fā)現(xiàn)，圖3A、B中均含有m/z 766.9，經(jīng)查找磷脂類后得知，正離子NLS 141 u中的m/z 768.8離子在負(fù)離子模式下剛好為766.9。再由LIPID MAPS工具得出相對分子質(zhì)量為767.8的PE分子總碳原子和雙鍵數(shù)為38和4。由此可以推測圖2B中的m/z 768.8為PE中脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)為C18:0和C20:4。以此多維質(zhì)譜法輔以二級質(zhì)譜可以解析所有檢出的磷脂分子雙鏈結(jié)構(gòu)，結(jié)果見表1。實驗共檢出18 種PC，21 種PE，12 種PI和16 種PS。不同種磷脂脂肪酸鏈各異，其碳鏈長度由16～22不等。

圖3 多維掃描測定磷脂脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)質(zhì)譜圖Fig. 3 Multi-dimensional mass spectra for identifying the structures of fatty acid chains of phospholipids

表1 烏鱧組織樣品中磷脂結(jié)構(gòu)與含量Table1 Structural characteristics and contents of phospholipids in Channa arrgguuss

2.3 烏鱧磷脂含量測定

鳥槍法磷脂定量采用歸一化法，其原理基于磷脂離子化特殊性質(zhì)。磷脂的偶極矩幾乎全部集中在極性頭部，故同一類磷脂離子化效率只與濃度相關(guān)，而脂肪酸鏈長度和不飽和度的影響可忽略不計[23-24]。利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，即可對所有磷脂分子進(jìn)行定量。烏鱧肌肉組織中，PC（708.13 μg/g）含量最多，PE（361.69 μg/g）次之，PI和PS含量相近，分別為129.93 μg/g和116.46 μg/g；磷脂酸和磷脂酰甘油未檢出。含有不飽和脂肪酸鏈的磷脂含量較多[25]，例如PC中C16:0/C22:6或C18:1/ C20:5的含量達(dá)到了124.89 μg/g。實驗中還測出了大量含有二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）鏈的磷脂，如C16:0/C20:5、C16:1/C22:6、C16:0/C22:6、C18:1/C20:5、C18:0/C22:6、C18:0/C22:5等。實驗表明，本方法前處理方法簡單有效，分析檢測過程中無需常規(guī)色譜分離手段，直接進(jìn)樣即可得到可靠結(jié)果，能為烏鱧等水產(chǎn)品脂質(zhì)組學(xué)快速分析提供基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

建立基于二醇基鍵合硅膠-SPE和多維度串聯(lián)質(zhì)譜鳥槍法的烏鱧組織中脂質(zhì)組學(xué)研究方法。共測定了PC、PE、PI及PS四類磷脂67 個分子，烏鱧中的磷脂富含多不飽和脂肪酸鏈，其sn-2位置尤以DHA鏈和EPA鏈居多。該方法具有便捷、靈敏度、精密度及準(zhǔn)確性好的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)方法相比避免了復(fù)雜的流動相體系和裝置，為脂質(zhì)組學(xué)在水產(chǎn)食品學(xué)科中的發(fā)展提供理論依據(jù)。

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SiO2/diol Based Solid-phase Extraction and Multi-dimensional Mass Spectrometry for Lipidomics Study of Channa argus

SHEN Qing, JIN Renyao, FENG Junli, XUE Jing, CHEN Kang, DAI Zhiyuan*
(Institute of Seafood, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China)

In this study, a method using SiO2/diol based solid-phase extraction (SPE) and multi-dimensional mass spectrometry-based shotgun lipidomics was developed for studying the phospholipids in muscle tissue of Channa argus. Crude lipids were extracted by the Folch method. Phospholipids were obtained by SiO2/diol-SPE, and it’s the extraction efficiency was compared with that of two other commercial SPE cartridges. The conditions for SiO2/diol-SPE were optimized as follows: loading volume, 100 μL; washing solvent pH 2, and 1 mL of 50% acetonitrile as eluent. The eluate was directly injected into the electrospray ionization (ESI) source. The phospholipid molecular species were identified and quantified using the precursor-ion scan and neutral loss scan modes, and the structures of two fatty acid chains in each species were confirmed by multi-dimensional mass spectrometry. The results showed that a total of 67 phospholipid molecular species were detected, including 18 phosphatidylcholines (PC), 21 phosphatidylethanoamines (PE), 12 phosphatidylinositols (PI), and 16 phosphatidylserines (PS). The phospholipids in C. argus contained abundant unsaturated fatty acyl chains. This analytical method proved to be simple, efficient, and reliable.

shotgun lipidomics; multi-dimensional mass spectrometry (MD-MS); SiO2/diol; solid-phase extraction (SPE); Channa argus

10.7506/spkx1002-6630-201702025

S912

A

1002-6630（2017）02-0154-05

沈清, 金仁耀, 馮俊麗, 等. 二醇基硅膠固相萃取-多維質(zhì)譜對烏鱧組織脂質(zhì)組學(xué)分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 154-158. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702025. http://www.spkx.net.cn

SHEN Qing, JIN Renyao, FENG Junli, et al. SiO2/diol based solid-phase extraction and multi-dimensional mass spectrometry for lipidomics study of Channa argus[J]. Food Science, 2017, 38(2): 154-158. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702025. http://www.spkx.net.cn

2016-06-16

國家國際科技合作專項（2014DFA32880）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31601542）；浙江省自然科學(xué)基金項目（LQ16C200001）

沈清（1986—），男，助理研究員，博士，研究方向為水產(chǎn)品營養(yǎng)與安全。E-mail：leonqshen@163.com

*通信作者：戴志遠(yuǎn)（1958—），男，研究員，學(xué)士，研究方向為水產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：dzy@zjgsu.edu.cn