韓玉芳，趙延兵，李 俊，李 理，李勇敢

蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是蔬菜中所發(fā)現(xiàn)的植物活性物質(zhì)，可增加正常細胞抵抗外來致癌物的能力，以達到抗癌作用[1]。蘿卜硫素通過對細胞癌變起始期階段的調(diào)控，促使癌細胞走向凋亡，抑制腫瘤血管形成和抑制癌細胞轉(zhuǎn)移擴散[2]。本研究就蘿卜硫素誘導(dǎo)肝癌Huh-6細胞凋亡的作用進行探討，為研究蘿卜硫素治療肝癌提供思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料細胞：人源肝癌細胞Huh-6，購自中科院上海細胞生物學(xué)研究所。藥品與試劑：蘿卜硫素純度99.8%，生產(chǎn)批號2016-02，購于西安昊軒生物科技有限責任公司；四唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；鼠源β-actin及兔源Ki-67、MMP-2、Bax、Cleave Caspase-3、二抗購自美國CST公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司。儀器：550-酶標儀，美國BIORAD公司。恒溫細胞培養(yǎng)箱(型號：3110)與超凈工作臺(型號：Heraguard ECO)，低溫離心機(型號：PICO 17)，美國Thermo公司；電泳儀(型號：DYC-Mini1)、電泳槽(型號：DYC-Mini1)，美國Bio-Rad公司。

1.2MTT法檢測蘿卜硫素對Huh-6細胞存活率將對數(shù)期狀態(tài)良好的Huh-6細胞以1×104細胞/孔種于96孔板。細胞貼壁后吸去原培養(yǎng)液，然后加含不同濃度(2、5、10、20、30、50、70、100 μM)蘿卜硫素培養(yǎng)液200 μL。對照組只加DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)20 h時每孔加入5 mg· mL-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，移去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO并震蕩5 min，酶標儀檢測每孔的吸光度(A)值。細胞存活率=給藥組A值/對照組A值×100%。

1.3AnnexinV-FITC/PI檢測Huh-6細胞凋亡將對數(shù)期狀態(tài)良好的Huh-6細胞以1×105細胞/孔接種于6孔板。細胞貼壁后吸去原培養(yǎng)液，然后加含不同濃度(10、20、30 μM)蘿卜硫素培養(yǎng)液2 mL。對照組只加DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。按試劑盒說明書收集細胞，然后加入FITC標記的Annexin-V，再加入PI，避光反應(yīng)5 min后，利用流式細胞儀進行檢測。

1.4Transwell小室觀察Huh-6細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力Huh-6細胞分為對照組與蘿卜硫素(20 μM)組，取100 μL細胞懸液加入Transwell小室，下室一般加適量完全培養(yǎng)基，按試劑盒說明書要求培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，吸去孔中培養(yǎng)液，按染色試劑盒說明書步驟進行染色，并于顯微鏡下觀察記數(shù)。

1.5免疫細胞化學(xué)法檢測Ki-67與MMP-2表達細胞分組處理同上，對照組不加藥物。培養(yǎng)24 h后，預(yù)冷PBS漂洗3～5遍，采用4%中性多聚甲醛固定25～35 min，然后實驗方法按免疫組化試劑盒說明書操作。

1.6Westernblot檢測目的蛋白的表達將細胞樣本進行裂解，從而提取蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。然后進行SDS-PAGE電泳與轉(zhuǎn)膜，加一抗(兔源Bax、Cleave Caspase-3與β-actin，1∶1 200稀釋)，并于4 ℃環(huán)境下孵育超過6 h。隨后HPR標記的二抗(1∶3 500)室溫孵育1 h，最后進行X線片曝光、顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1蘿卜硫素對Huh-6細胞增殖的抑制作用MTT檢測結(jié)果表明，與對照組(100%)相比，不同濃度(0、2、5、10、20、30、50、70、100 μM)蘿卜硫素的處理Huh-6細胞24 h，呈濃度依賴性地降低Huh-6細胞的存活率，而增加抑制作用(P<0.05)；2 μM和5 μM 蘿卜硫素組Huh-6細胞存活率未降低(P>0.05)，見圖1。

①與對照組相比較，P<0.05。圖1 不同濃度蘿卜硫素對Huh-6細胞存活率的影響

2.2蘿卜硫素誘導(dǎo)細胞凋亡Annexin V-FITC/PI結(jié)果顯示，經(jīng)(10、20、30 μM)蘿卜硫素處理后的Huh-6細胞，細胞存活率分別比對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)果表明，蘿卜硫素可以誘導(dǎo)肝癌Huh-6細胞凋亡，見圖2。

①與對照組相比較，P<0.05。圖2 Annexin V-FITC/PI檢測Huh-6細胞凋亡情況

2.3各組Huh-6細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力蘿卜硫素組Huh-6細胞經(jīng)蘿卜硫素(20 μM)處理后，與對照組相比，Huh-6細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力均下降，說明蘿卜硫素可以抑制Huh-6細胞侵襲與轉(zhuǎn)移，見圖3。

圖3 Transwell小室觀察Huh-6細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力(結(jié)晶紫染色，×400)

2.4蘿卜硫素對Huh-6細胞Ki-67與MMP-2表達Ki-67表達于細胞核中，MMP-2表達于細胞質(zhì)中，染色陽性信號呈棕黃色。與對照組相比，蘿卜硫素組Huh-6細胞Ki-67與MMP-2的表達均減少，呈弱陽性染色，且陽性細胞數(shù)明顯減少，見圖4。

圖4 Huh-6細胞Ki-67與MMP-2表達(免疫細胞化學(xué)染色，×400)

2.5Bax與CleaveCaspase-3表達與對照組相比，肝癌Huh-6細胞經(jīng)蘿卜硫素處理后，Bax、Cleave Caspase-3蛋白水平增高，結(jié)果提示明蘿卜硫素可以激活Bax與Caspase-3介導(dǎo)的凋亡通路，從而誘導(dǎo)人肝癌Huh-6細胞死亡，見圖5。

A:Huh-6細胞蛋白表達；B:Hub-6細胞蛋白表達灰度值①與對照組比較，P<0.05。Bax：凋亡蛋白；Cleave Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，β-actin：內(nèi)參。圖5 肝癌Huh-6細胞Bax與Cleave Caspase-3蛋白表達

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素衍生物誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞S期阻滯、細胞活性氧產(chǎn)生增加，且較蘿卜硫素作用明顯；蘿卜硫素能調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑中凋亡相關(guān)蛋白的表達，并可通過PI3K/Akt信號途徑誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡和S期阻滯[8]。慢性阻塞性肺氣腫患者的外周血巨噬細胞Toll樣受體(TLR4)、髓樣分化因子88(My D88)高表達，而蘿卜硫素可以降低TLR4、My D88高表達，從而減輕慢阻肺患者的炎癥反應(yīng)[9-10]。朱海鵬[11]觀察了蘿卜硫素對人前列腺癌LNCa P細胞增殖、周期及凋亡的影響以及IGFBP-3及NF-κB在此過程中的變化，發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素對LNCaP細胞的抑制作用可能與IGFBP-3有關(guān)，有研究顯示后者可能是通過改變NF-κB的表達發(fā)揮作用[12]。

蘿卜硫素處理Huh-6細胞24 h，呈濃度依賴性地降低Huh-6細胞的存活率，蘿卜硫素處理后的Huh-6細胞，細胞凋亡率明顯增加。同時，蘿卜硫素可以促進Bax表達，使Caspase-3裂解為發(fā)揮功能片段Cleave Caspase-3，從而介導(dǎo)肝癌Huh-6細胞凋亡。Caspase引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細胞死亡過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其激活主要包括線粒體依賴途徑和死亡受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細胞死亡[13-15]。Bax通過與Bcl-2B形成同源或異源二聚體來促使細胞走向死亡[16-18]，此時，Bax可與Bcl-2B形成異源二聚體時則抑制細胞凋亡[19-22]。另一方面，肝癌Huh-6細胞經(jīng)蘿卜硫素處理后，細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力均下降，免疫細胞化學(xué)結(jié)果提示，蘿卜硫素可以抑制肝癌細胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵蛋白Ki-67與MMP-2的表達，使得細胞增殖能力減小，且細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力下降，進一步促進蘿卜硫素誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡。

總之，本研究顯示蘿卜硫素可誘導(dǎo)肝癌Huh-6細胞增殖和凋亡，抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力。

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