崔冠一，彭 戰(zhàn)，李一鳴，沈國民

纖溶酶/纖溶酶原激活物系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞的遷移過程中起著至關(guān)重要的作用。纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitors,PAIs)，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，抑制纖溶酶原激活物的活性，限制活性纖溶酶的產(chǎn)生[1]。PAI主要有兩種類型，PAI-1和PAI-2。其中PAI-1與腫瘤細(xì)胞表型密切相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞的遷移和血管形成，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，是一個(gè)腫瘤預(yù)后因子。腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致實(shí)體瘤內(nèi)部形成低氧微環(huán)境，低氧引起一系列低氧應(yīng)答反應(yīng)，低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)在此過程中起著至關(guān)重要的作用[2-3]。HIFα亞基有兩種亞型:HIF1α、HIF2α，都含有bHLH和PAS結(jié)構(gòu)域，有研究報(bào)道HIF1α調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)[4]，也有研究稱PAI-1是HIF2α的靶基因[5]。因此，本研究用人肝癌細(xì)胞系(HepG2)和人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)研究低氧條件下HIF1α和HIF2α對(duì)PAI-1表達(dá)的影響，揭示PAI-1在肝癌腫和乳腺癌瘤細(xì)胞中表達(dá)升高的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料藥品與試劑：M-MLV Reverse Trancriptase及Ribonuclease Inhibitor為Promega 公司產(chǎn)品；TransStar SYBR Green qPCR SuperMix購自全式金公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒為威格拉斯公司產(chǎn)品；Human PAI-1 ELISA kit為Bender公司產(chǎn)品。Dharma FECT siRNA 轉(zhuǎn)染試劑為Thermo Scientific Dharmacon產(chǎn)品。HIF1α(sc-53546)抗體為鼠源單抗，二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG、抗兔IgG均購自Santa Cruz。HIF2α(NB100-122)抗體為兔源多抗，購自Novus。β-Actin(60008-1-1g)抗體為鼠源單抗，購自ProteinTech。丙烯酰胺、N’N’-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨(AP)、Penicillin、Streptamycin和 SDS 均為Sigma公司產(chǎn)品，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、MEM均為Gibco BRL公司產(chǎn)品；胰酶(Trypsin-EDTA)和Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)為PAA產(chǎn)品。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為MBI公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2和MCF-7分別生長于MEM-NEAA、DMEM培養(yǎng)基中，含有10%的胎牛血清(FBS)，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，2.5 mM L-Gln,培養(yǎng)條件均為37 ℃，5%CO2及飽和濕度。低氧培養(yǎng)箱為YCP系列三 氣培養(yǎng)箱(1%O2, 5%CO2, 94%N2)(長沙華曦電子科技有限公司)。HepG2和MCF-7分別在常氧(21%O2)、低氧(1%O2)下培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，提蛋白用于Western blot；提取總RNA用于實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR),收集培養(yǎng)基上清用于ELISA實(shí)驗(yàn)。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h傳代到6孔板，第2天細(xì)胞密度約50%～70%。siRNA轉(zhuǎn)染按廠家說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后給細(xì)胞換含有10%FBS的雙抗完全培養(yǎng)基，然后放入低氧箱，再過24 h，收培養(yǎng)基上清、RNA和蛋白，分別用于ELISA、Realtime PCR和Western blot分析。

1.2.3PAI-1含量測(cè)定按ELISA試劑盒方法進(jìn)行。

1.2.4RealtimePCR檢測(cè)PAI-1mRNA的表達(dá)用Bio-Rad iQ5 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，條件為95 ℃ 3 min預(yù)變性; 95 ℃10 s,60 ℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。HIF1α：上游引物5’-AGGTGGATATGTCTGGGTTG-3’；下游引物5’-AAGGACACATTCTGTTTGTTG-3’。HIF2α：上游引物5’-GTCTCTCCACCCCATGTCTC-3’；下游引物5’-GGTTCTTCATCCGTTTCCAC-3’。PAI-1：上游引物5’-TCTGCCCTCACCAACATTCTG-3’；下游引物5’-TGTCGGTCATTCCCAGGTTCT-3’。β-Actin：上游引物5’-CTGGCACCACACCTTCTACA-3’；下游引物5’-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3’。

1.2.5HIF1α和HIF2α表達(dá)蛋白免疫印跡收集6孔板細(xì)胞，用SDS裂解液(50 mM Tri-Cl pH6.8，2%SDS,10%glycerol)提取總蛋白進(jìn)行蛋白的SDS-PAGE電泳，每孔上樣量為100 μg全細(xì)胞抽提物。之后蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。電轉(zhuǎn)完畢的PVDF膜在TBST (20 mM Tris 8.0, 100 mM NaCl, 0.1%Tween-20)溶液中洗滌5 min。將PVDF膜放于含有5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h。再將膜放于封閉稀釋的一抗溶液中，4 ℃孵育過夜。第2天TBST洗膜3次，每次10 min。再將膜放于封閉稀釋的二抗溶液中，室溫孵育1～2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。之后用ECL試劑顯影，在暗室中壓X線片，曝光時(shí)間3 s～5 min，然后分別用顯影液和定影液顯影和定影。

2 結(jié)果

2.1低氧誘導(dǎo)HepG2和MCF-7細(xì)胞中PAI-1的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，低氧時(shí)HepG2和MCF-7中,HIF1α和HIF2α蛋白表達(dá)量均明顯升高，而內(nèi)參β-Actin的表達(dá)無明顯變化(圖1A)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)低氧時(shí)PAI-1 mRNA升高(圖1B)。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平明顯增加(圖1C)。在HepG2細(xì)胞中，低氧時(shí)PAI-1 mRNA水平與常氧下相比，升高了約59倍(圖1B)，培養(yǎng)基上清中PAI-的含量上升了約114倍(圖1C)。在MCF-7細(xì)胞中，低氧時(shí)PAI-1 mRNA水平與常氧下相比，升高了約11倍(圖1B)，培養(yǎng)基上清中PAI-1的含量升高了約3倍(圖1C)。

2.2在HepG2中低氧下HIF2α主要調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過HepG2細(xì)胞以后，低氧時(shí)HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了(圖2A, 2B)。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PAI-1mRNA的表達(dá)，在HepG2中敲低 HIF2α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低 HIF1α對(duì)PAI-1 mRNA水平無明顯變化。用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平的表達(dá)，敲低 HIF2α顯著降低PAI-1水平，而敲低 HIF1α對(duì)PAI-1表達(dá)無明顯變化(圖3C)。

A:Western blot檢測(cè)HIF1α和HIF2α在HepG2和MCF-7中低氧和常氧下的表達(dá)；B:低氧誘導(dǎo)PAI-1 mRNA升高；C:低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清中PAI-1的蛋白水平明顯增加。圖1 低氧誘導(dǎo)HepG2和MCF-7細(xì)胞系高表達(dá)PAI-1

A:低氧下敲低HIF2α顯著降低PAI-1 mRNA 的表達(dá)；B:HIF1α和HIF2α的siRNA 特異敲低HIF1α和HIF2α的蛋白表達(dá)；C:低氧下敲低HIF2α顯著降低PAI-1的蛋白水平。圖2 在HepG2中低氧下HIF2α主要調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)

2.3在MCF-7中低氧下HIF1α主要調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過MCF-7細(xì)胞后，低氧時(shí)HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了(圖3A,3B)。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PAI-1mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低 HIF1α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低 HIF2α對(duì)PAI-1 mRNA水平無明顯變化(圖3C)。用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低 HIF1α顯著降低PAI-1水平，而敲低 HIF2α對(duì)PAI-1表達(dá)無明顯變化。

A:低氧下敲低HIF1α顯著降低PAI-1 mRNA 的表達(dá)水平；B:HIF1α和HIF2α的siRNA 特異敲低HIF1α和HIF2α的蛋白表達(dá)；C:低氧下敲低HIF1α顯著降低PAI-1的蛋白水平。圖3 在MCF-7中低氧下HIF1α主要調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)

3 討論

腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致實(shí)體瘤內(nèi)部形成低氧微環(huán)境，低氧引起一系列低氧應(yīng)答反應(yīng)，HIF在此過程中起著至關(guān)重要的作用[4-5]。HIF是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，它由兩個(gè)堿性螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)亞基組成：HIFα和HIFβ。HIFα亞基有兩種亞型：HIF1α、HIF2α。HIF1α和HIF2α具有相似的結(jié)構(gòu)，都含有bHLH和PAS結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合以及與HIFβ二聚化，同時(shí)HIF1α和HIF2α蛋白都含有氧依賴的降解結(jié)構(gòu)域(ODDD)，因此α亞基在常氧下被迅速降解[6-7]。β亞基是不依賴于氧氣的組成型表達(dá)蛋白。低氧、鐵螯合劑以及α-酮戊二酸類似物均能引起HIFα蛋白的穩(wěn)定，從而與HIFβ亞基二聚化，該復(fù)合體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，結(jié)合于靶基因的順式反應(yīng)元件(低氧反應(yīng)元件，HRE，核心模體序列為5’-(A/G)CGTG-3’)，從而引起靶基因的轉(zhuǎn)錄。盡管低氧下HIF1α和HIF2α可能共同參與某個(gè)特定基因的表達(dá)，但二者并不冗余。有報(bào)道HIF1α和HIF2α具有不同的反式激活結(jié)構(gòu)域，這表明二者可能有各自獨(dú)特的靶基因，而這種特異性可能取決于細(xì)胞類型和基因種類[6-10]。

PAI-1是一個(gè)分子量約為52 kDa的糖蛋白,最初是定位于內(nèi)皮細(xì)胞的一種蛋白?，F(xiàn)已證實(shí)體外低氧條件下會(huì)引起PAI-1基因的表達(dá)上調(diào)[2,7]。本研究在HepG2細(xì)胞中，低氧時(shí)PAI-1 mRNA水平與常氧下相比，升高了約59倍，培養(yǎng)基上清中PAI-的含量上升了約114倍。在MCF-7細(xì)胞中，HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過HepG2細(xì)胞以后，低氧時(shí)HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了。在HepG2中敲低 HIF2α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低HIF1α對(duì)PAI-1 mRNA水平無明顯變化。敲低 HIF2α顯著降低PAI-1蛋白水平，而敲低 HIF1α對(duì)PAI-1蛋白表達(dá)無明顯變化。結(jié)果表明HIF1α或者HIF2α特異性的siRNA處理過MCF-7細(xì)胞后，低氧時(shí)HIF1α或HIF2α的mRNA和蛋白水平都顯著降低了。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PAI-1mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低 HIF1α顯著降低PAI-1 mRNA水平，而敲低 HIF2α對(duì)PAI-1 mRNA水平無明顯變化。用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清中PAI-1蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低 HIF1α顯著降低PAI-1水平，而敲低 HIF2α對(duì)PAI-1表達(dá)無明顯變化。結(jié)果與之前的報(bào)道一致[2-4]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧下在HepG2細(xì)胞系中HIF2α主要調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)，而在MCF-7中HIF1α主要調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)。PAI-1基因，像其他低氧反應(yīng)基因一樣，在其啟動(dòng)子區(qū)含有低氧反應(yīng)元件，被HIF結(jié)合后促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。然而PAI-1在不同腫瘤中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能有差異。有報(bào)道HIF1α調(diào)節(jié)PAI-1基因的表達(dá)[11-12]，也有文獻(xiàn)報(bào)道PAI-1是HIF2α的靶基因[3]。本研究說明在肝癌和乳腺癌中，PAI-1的高表達(dá)機(jī)制是不一樣的。因此在肝癌和乳腺癌的治療中要針對(duì)不同的靶標(biāo)來抑制PAI-1的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的目的。

[1]PannekoekH,VeermanH,LambersH,et al.Endothelial plasminogen activator inhibitor (PAI):a new member of the Serpin gene family[J].EMBO J,1986,5(10):2539-2544.

[2]Chi JT,Wang Z,Nuyten DS,et al.Gene expression programs in response to hypoxia:cell type specificity and prognostic significance in human cancers[J].PLoS Med,2006,3(3):47.

[3]Schilling D,Bayer C,Geurts-Moespot A,et al.Induction of plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) by hypoxia and irradiation in human head and neck carcinoma cell lines[J].BMC Cancer,2007,7(1):143.

[4]Fink T,Kazlauskas A,Poellinger L,et al.Identification of a tightly regulated hypoxia-response element in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-1[J].Blood,2002,99(6):2077-2083.

[5]Sato M,Tanaka T,Maemura K,et al.The PAI-1 gene as a direct target of endothelial PAS domain protein-1 in adenocarcinoma A549 cells[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2004,31(2):209-215.

[6]Raval RR,Lau KW,Tran MG,et al.Contrasting properties of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindau-associated renal cell carcinoma[J].Mol Cell Biol,2005,25(13):5675-5686.

[7]Elvidge GP,Glenny L,Appelhoff RJ,et al.Concordant regulation of gene expression by hypoxia and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase inhibition:the role of HIF-1 alpha,HIF-2alpha,and other pathways[J].J Biol Chem,2006,281(22):15215-15226.

[8] Taniguchi CM,Miao YR,Diep AN,et al.PHD inhibition mitigates and protects against radiation-induced gastrointestinal toxicity via HIF2[J].Sci Transl Med,2014,6(236):236-264.

[9] Chen W,Hill H,Christie A,et al.Targeting renal cell carcinoma with a HIF-2 antagonist[J].Nature,2016,539(7627):112-117.

[10]Shah T,Krishnamachary B,Wildes F,et al.HIF isoforms have divergent effects on invasion, metastasis, metabolism and formation of lipid droplets [J].Oncotarget,2015,6(29):28104-28119.

[11]Kimura D,Imaizumi T,Tamo W,et al.Hypoxia enhances the expression of plasminogen activator inhibitor-1 in human lung cancer cells,EBC-1[J].Tohoku J Exp Med,2002,196(4):259-267.

[12]Jung SY,Song HS,Park SY,et al.Pyruvate promotes tumor angiogenesis through HIF-1-dependent PAI-1 expression[J].Int J Oncol,2011,38(2):571-576.