黃 興， 朱镕鑫, 霍彩云, 唐玉玲, 韓天雨, 于加倍， 張瑋佳， 胡 揚(yáng)

(1.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 海淀 100084 ； 2.首都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)與健康學(xué)院，北京 海淀 100191；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193 ； 4.北京體育大學(xué)中國(guó)運(yùn)動(dòng)與健康研究院，北京 海淀 100084)

瞬時(shí)感受器電位離子通道家族香草素受體亞家族Ⅳ型(Transient Receptor Potential Vanilloid 4，TRPV4)通道對(duì)于細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控起重要作用[1-2]。人們發(fā)現(xiàn)，TRPV4通道是一種能被因低滲引起的細(xì)胞腫脹而激活的離子通道[3-4]，可被溫?zé)?、機(jī)械、花生四烯酸及其代謝物等多種刺激所激活[5-6]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TRPV4通道主要分布于大腦皮層、海馬、丘腦、小腦等部位[7]。研究前額皮質(zhì)TRPV4通道在低氧環(huán)境中運(yùn)動(dòng)時(shí)的變化，對(duì)于后期深入研究低氧運(yùn)動(dòng)中前額皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞鈣離子通道的變化情況將奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 本研究以120只體重在280～300 g的Wistar大鼠為研究對(duì)象，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過北京體育大學(xué)動(dòng)物福利論理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，室溫20 ℃～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，每日12 h光照/12 h熄燈，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)詞料喂養(yǎng)，大鼠自由飲水、采食。普通動(dòng)物房模擬平原常氧狀態(tài)，采用模擬低氧發(fā)生器在低氧房分別模擬海拔2 500 m(低氧1)和4 500 m低氧(低氧2)狀態(tài)。將大鼠隨機(jī)分為12組，每組10只，分別是常氧-安靜組(常-安組)、常氧-5級(jí)組(常-5級(jí)組)、常氧-8級(jí)組(常-8級(jí)組)、常氧-力竭組(常-竭組)、低氧1-安靜組(低1-安組)、低氧 1-5 級(jí)組(低1-5級(jí)組)、低氧1-8級(jí)組(低1-8級(jí)組)、低氧1-力竭組(低1-竭組)、低氧2-安靜組(低2-安組)、低氧2-5級(jí)組(低2-5級(jí)組)、低氧2-8級(jí)組(低2-8級(jí)組)、低氧2-力竭組(低 2-竭組)。

1.2 大鼠適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練方案 大鼠適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練5 d，速度為10 m/min，每天15 min。大鼠適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練期結(jié)束后間隔1 d，進(jìn)行遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，并按照?qǐng)D1所示的流程進(jìn)行剖檢取材。

圖1 取材流程

1.3 大鼠遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)方案 大鼠的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)方案參照Leadro基于Wistar大鼠最大攝氧量測(cè)試模型。采用逐級(jí)遞增負(fù)荷進(jìn)行測(cè)試。坡度不變，10°傾斜角，起始速度5 m/min，最大速度50 m/min。第一級(jí)負(fù)荷持續(xù)時(shí)間為4 min，此后每一級(jí)負(fù)荷持續(xù)3 min，直至力竭[8]。

1.4 取材 用3%戊巴比妥鈉(0.25 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉。待麻醉好后，腹主動(dòng)脈取血并迅速取出腦組織，切下部分前額皮質(zhì)置于4%甲醛中固定。

表1 大鼠遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)方案[8]

1.5 石蠟切片和H.E.染色 將固定好的前額部分用梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、石蠟切片，每個(gè)大腦連續(xù)切片，5張取一張，共取6張。常規(guī)蘇木素伊紅染色，奧林帕斯顯微鏡BX43觀察拍照。

1.6 免疫組化染色 (1)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，下行至蒸餾水；(2)PBS洗3次，每次5 min；(3)3%過氧化氫室溫避光作用20 min；(4)蒸餾水洗，PBS洗3次，每次5 min；(5)5%牛血清白蛋白封閉液室溫作用30 min；(6)倒掉封閉液后，滴加已稀釋好的一抗(兔源TRPV4多克隆抗體1∶200倍稀釋)，4 ℃過夜；(7)PBS洗3次，每次5 min；(8)滴加試劑1(聚合物輔助劑)，37 ℃作用30 min；(9)PBS洗3次，每次5 min；(10)滴加試劑2(辣根過氧化物酶多聚體標(biāo)記的山羊抗兔IgG)，37 ℃ 作用30 min；(11)PBS洗3次，每次5 min；(12)滴加DAB顯色液，室溫避光作用2～10 min，顯微鏡下控制顯色時(shí)間；(13)蒸餾水洗，蘇木素染液作用5 min；(14)蒸餾水洗，1%鹽酸酒精分色10 s，經(jīng)0.1 mol/L pH值7.4 PBS藍(lán)化作用15 min；(15)經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察。同時(shí)設(shè)染色對(duì)照，即一抗替代為PBS。評(píng)級(jí)方法：0=沒有陽(yáng)性細(xì)胞；1=1～5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞；2=6～10個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞；3=11～15個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞；4=16～20個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞；5=多于20個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 H.E.染色結(jié)果 各組腦組織病理變化如中插彩版圖2所示。

圖2 大腦前額皮質(zhì)HE染色圖(H.E. 40×)

注：黑色箭頭指示水腫，空三角指示淤血，三角形指示嗜神經(jīng)現(xiàn)象，五角星指示結(jié)構(gòu)疏松、偶見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。A：常-安組，B：常-5級(jí)組，C：常-8級(jí)組，D：常-竭組，E：低1-安組，F(xiàn)：低1-5級(jí)組，G：低1-8級(jí)組，H：低1-竭組，I：低2-安組，J：低2-5級(jí)組，K：低2-8級(jí)組，L：低2-竭組

常氧組：第5級(jí)小鼠腦組織可見水腫，血管與周邊組織間隙增寬；第8級(jí)腦組織可見水腫、血管擴(kuò)張充血；力竭組可見腦膜下靜脈淤血。

低1組(2 500 m組)：第5級(jí)可見腦組織小血管擴(kuò)張充血，第8級(jí)可見膠質(zhì)細(xì)胞嗜神經(jīng)現(xiàn)象，靜脈淤血；力竭組可見腦膜疏松水腫、腦膜下和皮質(zhì)部靜脈淤血。

低2組(4 500 m組)：安靜組可見小血管擴(kuò)張充血現(xiàn)象；第5級(jí)靜脈淤血，可見膠質(zhì)細(xì)胞嗜神經(jīng)現(xiàn)象；第8級(jí)可見膠質(zhì)細(xì)胞嗜神經(jīng)現(xiàn)象，腦膜下靜脈淤血；力竭組細(xì)胞間組織疏松，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，腦膜下淤血出血、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 免疫組化結(jié)果 如中插彩版圖3和圖4所示，TRPV4陽(yáng)性信號(hào)顯示為棕黃色，主要分布在神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中。無論在常氧環(huán)境還是低氧環(huán)境，隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的遞增，大鼠大腦前額皮質(zhì)TRPV4的表達(dá)量顯著增高，各環(huán)境下5級(jí)、8級(jí)和力竭組均顯著高于同環(huán)境安靜組(P<0.01)。

安靜狀態(tài)下，低1-安組TRPV4表達(dá)量顯著高于常-安組(P<0.05)，低2-安組與常-安組比具有非常顯著性差異(P<0.01)；5級(jí)狀態(tài)下，低2～5級(jí)組與常-5級(jí)組比具有非常顯著性差異(P<0.01)；8級(jí)狀態(tài)下，低1～8級(jí)組與常-8級(jí)組比具有顯著性差異(P<0.05)，低2～8級(jí)組與常-8組相比具有非常顯著性差異(P<0.01)；力竭狀態(tài)下，低1-竭組和低2-竭組與常-竭組比均具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 大腦前額皮質(zhì)TRPV4蛋白免疫組化染色圖(IHC, 40×)

注：箭頭所示為TRPV4陽(yáng)性信號(hào)。A：常-安組，B：常-5級(jí)組，C：常-8級(jí)組，D：常-竭組，E：低1-安組，F(xiàn)：低1-5級(jí)組，G：低1-8級(jí)組，H：低1-竭組，I：低2-安組，J：低2-5級(jí)組，K：低2-8級(jí)組，L：低2-竭組

圖4 大腦前額皮質(zhì)TRPV4免疫組化陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

TRPV4通道最早是于2000年由Liedtke等人提出[9]。人類的TRPV4基因存在于12q23～q24染色體上，表達(dá)于第15號(hào)外顯子上[10]。目前己確定TRPV4的5種亞型，分別是TRPV4-A～E。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)儲(chǔ)留、低聚反應(yīng)缺失和通道失活的現(xiàn)象可由亞型B, C和E在N-末端錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(ANK)的缺失所導(dǎo)致[11-12]。結(jié)構(gòu)上，TRPV4通道蛋白由871個(gè)氨基酸組成，氨基端和羧基端均位于胞質(zhì)側(cè)，其具有6個(gè)跨膜區(qū)(S1-6)，在S5與S6區(qū)之間有一個(gè)發(fā)卡通道結(jié)構(gòu)，形成孔通道環(huán)，該孔通道環(huán)允許鈣離子等陽(yáng)離子通過[13-14]。TRPV4通道蛋白約30%體積位于胞膜上，約70%暴露于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為其與細(xì)胞內(nèi)外的蛋白相互作用從而調(diào)節(jié)通道的功能提供了極大便利[15]。起初，人們發(fā)現(xiàn)TRPV4通道是一種能被因低滲引起的細(xì)胞腫脹而激活的離子通道[3-4]。后續(xù)研究表明，TRPV4通道還可被溫?zé)帷C(jī)械、花生四烯酸及其代謝物等多種刺激所激活[5-6]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TRPV4通道主要分布于大腦皮層、海馬、丘腦、小腦等部位[7]。

大腦缺血缺氧時(shí)，主要通過以下兩方面激活TRPV4通道：一方面，大腦缺血缺氧造成細(xì)胞水腫，因而通過改變細(xì)胞膜機(jī)械張力激活TRPV4通道；另一方面，大腦缺血缺氧造成能量代謝障礙，產(chǎn)生的大量花生四烯酸(AA)通過其代謝產(chǎn)物5,6-環(huán)氧二十碳三烯甘油酸(5,6-EET)等也能激活TRPV4通道[16]。

H.E.染色結(jié)果顯示，4 500米海拔高度運(yùn)動(dòng)至第5級(jí)，靜脈淤血現(xiàn)象明顯，與常氧運(yùn)動(dòng)第8級(jí)所出現(xiàn)的癥狀相似；4 500米海拔高度第8級(jí)，腦膜疏松水腫、腦膜下靜脈淤血，與常氧力竭和2 500 m海拔高度力竭所出現(xiàn)的癥狀相似。隨著海拔高度的升高，低氧刺激可導(dǎo)致大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠前額皮質(zhì)細(xì)胞腫脹、靜脈出血、腦膜下靜脈出血等現(xiàn)象更加明顯，可能是運(yùn)動(dòng)疲勞提前的重要原因。

免疫組化結(jié)果顯示，常氧環(huán)境中隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的不斷遞增，TRPV4表達(dá)量增高，結(jié)合H.E.染色結(jié)果，可能由于運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大腦缺氧，進(jìn)而細(xì)胞膜張力改變，激活了TRPV4通道。同時(shí)，模擬海拔高度的增加，即環(huán)境氧濃度的降低，也明顯改變了大鼠前額皮質(zhì)TRPV4的表達(dá)量。即使安靜狀態(tài)下，2 500 m海拔高度TRPV4的表達(dá)量也會(huì)顯著高于常氧，4 500 m海拔高度的TRPV4表達(dá)量非常顯著性增高。三組組間同級(jí)比較，也均有顯著差異，說明低氧環(huán)境可對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠TRPV4的表達(dá)量有顯著影響，為后期深入研究低氧環(huán)境下中樞神經(jīng)細(xì)胞膜鈣離子通道變化所致的運(yùn)動(dòng)疲勞提前出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

首先，大鼠急性低氧環(huán)境遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)較常氧提前出現(xiàn)大腦前額皮質(zhì)組織病理變化。其次，低氧環(huán)境可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)大鼠腦前額皮質(zhì)組織中TRPV4通道蛋白表達(dá)量顯著升高。

[1] Dunn K M，Hill-Eubanks D C，Liedtke W B，etal．TRPV4 channels stimulate Ca2+-induced Ca2+release in astrocytic end feet and amplify neurovascular coupling responses[J]. ProcNatlAcadSci USA, 2013, 110(15): 6 157-6 162．

[2] 黃海燕，張世忠. 神經(jīng)血管耦合中鈣信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 廣東醫(yī)學(xué),2016, 37(6): 947-949.

[3] Liedtke W, Choe Y, Marti-Renom M A,etal. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor[J]. Cell, 2000, 103(3): 525-535.

[4] Nilius B, Prenen J, Wissenhach U,etal. Differential activation of the volume-sensitive cation channel TRP12 (OTRPC4) and volume-regulated anion currents in HEK-293 cells[J]. PflugersArchiv: Eur J Physiol, 2001, 443(2): 227-233.

[5] Plant T D,Strotmann R.TRPV4: A Multifunctional Nonselective Cation Channel with Complex Regulation[J]. HandbExpPharmacol, 2007, 179: 189-205.

[6] Kanju P, Liedtke W. Pleiotropic function of TRPV4 ion channels in the central nervous system[J]. Exp Physiol, 2016, 101(12): 1 472-1 476.

[7] Shibasaki K, Suzuki M, Mizuno A,etal. Effects of body temperature on neural activity in the hippocampus: regulation of resting membrane potentials by transient receptor potential vanilloid 4[J]. J Neurosci, 2007, 27: 1 566-1 575.

[8] Leandro C G, Levada A C, Hirabara S M,etal. A program of moderate physical training for Wistar rats based on maximal oxygen consumption[J]. J strength Cond Res, 2007, 21 (3): 751-756.

[9] Vriens J, Watanabe H, Janssens A,etal. Cells welling; heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cat ion channel TRPV4[J]. ProcNatlAcadSci U S A, 2004, 101(1): 396-401.

[10] Anna Garcia-Elias, SanelaMrkonjic, Carole Jung,etal. The TRPV4 Channel[J]. HandbExpPharmacol, 2014, 222:293-319.

[11] Arniges M, Fernandez J M, Albrecht N,etal. Human TRPV4 channel splice variants revealed a key role of ankyrin domains in multimerization and trafficking[J]. J BiolChem, 2006, 281(13): 1 580-1 586.

[12] Vazquez E, Valverde M A. A review of TRP channels splicing[J]. Semin Cell DevBiol, 2006，17(6):607-617.

[13] Suresh K, Servinsky L, Reyes J,etal. Hydrogen peroxide induced calcium influx in lung microvascular endothelial cells involves TRPV4[J]. Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol, 2015, 309(12): 1 467-1 477.

[14] Everaerts W, Nilius B, Owsianik G. The vanilloid transient receptorpotential channel TRPV4: from structure to disease[J]. ProgBiophysMolBiol, 2010, 103(1): 2-17.

[15] Verma P, Kumar A, Goswami C. TRPV4-mediated channel opathies[J]. Channels (Austin), 2010, 4(4): 319-328.

[16] Vriens J, Appendino G, Nilius B. Pharmacology of vanilloid transient receptor potential cation channels[J]. MolPharmacol, 2009, 75(6): 1 262-1 279.