郭璐璐 ， 崔言順

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東 泰安 271018)

由口瘡病毒(ORFV)引起的羊口瘡是危害嚴(yán)重的人獸共患病之一，該病主要發(fā)生在綿羊、山羊和多種野生動(dòng)物[1]，直接接觸動(dòng)物或接觸被ORFV污染的物品是人類感染的重要原因，該病幾乎在世界上所有養(yǎng)羊的國(guó)家都有發(fā)生。該病死亡率不高，但由于發(fā)病部位特殊嚴(yán)重影響被感染動(dòng)物的采食及生產(chǎn)性能。王晴楠等[2]對(duì)我國(guó)1984-2014年羊口瘡報(bào)道文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)分析表明，該病在我國(guó)24個(gè)省份都有發(fā)生，西北、東北及西南地區(qū)為該病的重災(zāi)區(qū)，此外，山東、廣東、云南等地也出現(xiàn)該病的發(fā)生和流行。口瘡病毒(ORFV)屬于痘病毒科脊索亞科副痘病毒屬的嗜上皮型雙鏈DNA病毒，病毒粒子呈磚形或橢圓形，其表面呈繩索樣縱橫交錯(cuò)排列結(jié)構(gòu)[3]。到目前為止，分離鑒定并獲得全基因組序列的ORFV毒株基因組長(zhǎng)度不一[4-5]，G+C含量高達(dá)64%，都編碼132個(gè)基因，在基因組的兩側(cè)末端區(qū)域的閱讀框有很大差異，這些差異也許是ORFV毒力和免疫逃逸功能差異的最重要部位[4-6]。

2017年3月，在廣東大浦地區(qū)某黑山羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了一例疑似羊口瘡病毒感染的病例，我們進(jìn)行了病毒的分離、鑒定和重要免疫原及毒力基因的遺傳演化分析，這為該地區(qū)羊口瘡的綜合防控及監(jiān)測(cè)提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料的采集與處理 2017年3月在廣東大浦某羊場(chǎng)無菌采集疑似發(fā)生口瘡病羔羊的唇部增生物備用。對(duì)采集的山羊口唇部增生物剪碎、加入4 ℃預(yù)冷的無菌PBS研磨成懸液，同時(shí)加入雙抗，以5 000 r/min離心10 min，用0.45 μm過濾器過濾上清液凍存于超低溫冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)材料 胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基MEM，購(gòu)自Gibco公司；青霉素/鏈霉素(雙抗)磷酸鹽緩沖液(PBS)，購(gòu)自美國(guó)Geneview公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、LATaqDNA連接酶、pMD18-T載體、總DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 病毒分離 OFTu細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寧章勇教授惠贈(zèng)，按照文獻(xiàn)的方法[1-2,6]進(jìn)行培養(yǎng)。取1.2中的病料上清液1 mL接種于生長(zhǎng)良好的OFTu細(xì)胞，37 ℃吸附1 h，吸附完成后棄上清液更換完全培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)(CPE)，反復(fù)凍融3次，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，12 000 r/min離心 10 min，將上清1 mL接種到新的細(xì)胞中，連續(xù)盲傳4代，直到細(xì)胞出現(xiàn)明顯CEP，將病毒液凍存于超低溫冰箱。

1.4 病毒DNA提取 按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書，從1.3分離的病毒液中提取病毒DNA，獲得的病毒DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ORFV廣東大浦株ORFV 011基因和ORFV 059基因的擴(kuò)增與克隆 參考GenBank中登錄的羊口瘡病毒基因組序列(AY386263)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，所有引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物信息如下，ORFV 011上游引物：5′-ATGTGGCCGTTCTCCTTATC-3′，下游引物：5′-TTAATTTATTGGCTTGCAG-3′；ORFV 059上游引物：5′-ATGGATCCACCCGAAATCAC-3′，下游引物：5′-TCACACGATGGCCGTGACCAG-3′。以總DNA提取試劑盒抽提病毒基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用25 μL的PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL(2.5 mmol/L)，cDNA模板 1 μL，上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，LATaqDNA聚合酶0.2 μL(5U/μL)，超純水17.3 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取6 μL PCR反應(yīng)液在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果?；厥誔CR擴(kuò)增的目的片段，然后分別連接到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，搖均提質(zhì)粒，將跑膠鑒定正確的質(zhì)粒送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.6 ORFV廣東大浦株ORFV 011基因和ORFV 059基因的遺傳進(jìn)化分析 針對(duì)ORFV 011基因和 ORFV 059基因構(gòu)建進(jìn)化樹，選取數(shù)據(jù)庫(kù)里含有全基因序列的不同ORFV分離株的ORFV 011基因和ORFV 059基因序列，這些序列經(jīng)MEGA 5.0軟件比對(duì)處理后用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊的發(fā)病情況 發(fā)病羊場(chǎng)養(yǎng)殖的是本地黑山羊，共200多只，發(fā)病羊?yàn)?0只左右，發(fā)生率約為10%；發(fā)病年齡不一，從羔羊到成年羊都有。羔羊發(fā)病后由于吸奶困難，極易死亡；成年羊采食困難，消瘦。發(fā)病羊都具有類似的臨床表現(xiàn)，在口唇部形成典型增生壞死灶，嚴(yán)重者在舌上形成潰瘍和增生灶(見中插彩版圖1)，病羊幾乎不能采食。

圖1 發(fā)病羊的口腔、唇及舌部形成的增生壞死灶

2.2 病毒的分離 將采集的病羊痂皮組織按照前面描述的方法接種至OFTu細(xì)胞，在盲傳4代后，OFTu細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE病變(見中插彩版圖2)，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變圓、聚堆和死亡等現(xiàn)象。盲傳4代后，收取病毒液，將該病毒分離株命名為ORFV-GDDP。

圖2 感染ORFV后OFTu細(xì)胞病變

2.3 病毒的PCR鑒定 對(duì)具有標(biāo)志性的ORFV 011基因和ORFV 059基因進(jìn)行擴(kuò)增。用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)提取的病毒基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示:1，在1 000 bp至1 500 bp之間出現(xiàn)一條大小約為1 137 bp的特異性條帶，符合ORFV 011基因大??；2，出現(xiàn)一條約為1 059 bp的特異性條帶，符合ORFV 059基因大小(圖3)。將擴(kuò)增的目的條帶分別膠回收、克隆以及測(cè)序。結(jié)果證明我們分離的病毒是羊口瘡病毒，將其命名為ORFV-GDDP分離株，獲得的序列提交至BenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)分別為：MF034455(ORFV 011)、MF034456(ORFV 059)。

圖3 ORFV 011基因和ORFV 059基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 病毒基因的進(jìn)化樹分析 對(duì)ORFV 011基因和ORFV 059基因使用MEGA 5.0軟件中Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。分離的病毒為羊口瘡病毒，ORFV 011基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GDDP株與新疆毒株xiangjian2和福建毒株FJ-YX、FZ毒株在同一分支上(圖4)。ORFV 059基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GDDP分離株與福建毒株FJ-SL和DG在同一分支上(圖4)。

3 討論

羊口瘡病毒感染山羊和綿羊后，會(huì)造成口、唇、鼻、舌、乳房等部位出現(xiàn)丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)痂[7]，在口腔部位由于壞死、結(jié)痂和組織的修復(fù)再生多次重復(fù)發(fā)生，會(huì)形成巨大的感染性創(chuàng)傷修復(fù)灶，這會(huì)嚴(yán)重的影響山羊的采食。在本次羊群暴發(fā)的羊口瘡中，口腔部位是主要的受害部位。該病毒可在牛、綿羊、山羊的腎細(xì)胞以及犢牛和羔羊的睪丸細(xì)胞上生長(zhǎng)，并形成細(xì)胞病變[6-7], 我國(guó)早期的研究工作均采取了上述細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離和鑒定工作。2013年，汪園園等[8]報(bào)道了從120日齡羊胚胎鼻甲上分離的上皮細(xì)胞(OFTu)具有增殖ORFV效價(jià)高、細(xì)胞病變顯著的特點(diǎn)，非常適用于ORFV的體外增殖和致病機(jī)制的研究。自此，OFTu細(xì)胞開始廣泛用于ORFV的分離和鑒定。在本研究中，我們采用了該細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離和鑒定，經(jīng)過4代盲傳即獲得了純化病毒。經(jīng)過對(duì)ORFV 011基因和059基因的擴(kuò)增、測(cè)序，證明我們分離的病毒確實(shí)為羊口瘡病毒。從山羊的臨床表現(xiàn)以及后期的病毒分離、病毒編碼基因的擴(kuò)增和測(cè)序等多方面證明，該病為羊口瘡。

圖4 GDDP株ORFV011基因的進(jìn)化樹

圖5 GDDP株ORFV059基因的進(jìn)化樹

經(jīng)PCR擴(kuò)增GDDP株ORFV的011基因和059基因，獲得了其全基因序列，序列的進(jìn)化分析表明，ORFV 011基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GDDP株與新疆毒株xiangjian2和福建毒株FJ-YX、FZ毒株在同一分支上。ORFV 059基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GDDP分離株與福建毒株FJ-SL和DG在同一分支上。由于羊口瘡病毒基因組具有廣泛的容納性所造成的同源或非同源基因重組和非必須基因缺失的特殊性[5-6,9-10]，我們懷疑GDDP株ORFV可能是重組病毒。后期的調(diào)查表明，大浦當(dāng)?shù)赜袕母＝ê托陆?gòu)買的山羊和綿羊，并且這些羊群也發(fā)生了羊口瘡，這也進(jìn)一步證明了大浦當(dāng)?shù)亓餍械腛RFV病毒株極有可能是來源于福建和新疆等地的毒株的重組病毒。羊口瘡病毒的這種特性，決定了羊口瘡防控極其困難，因此制定羊口瘡的綜合防控措施時(shí)，必須考慮病毒流行毒株的分子特性。鑒于廣東省地處亞熱帶、水量充沛，植物性資源豐富，近年來山羊養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，羊口瘡造成的危害逐年增加，有必要對(duì)廣東省進(jìn)行ORFV系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，為該地區(qū)羊口瘡的綜合防控提供科學(xué)的依據(jù)。

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