徐耀輝 ， 鄧同煒 ， 齊亞如 ， 韓文龍 ， 韓雨奇 ， 蔣增海 ， 盧建洲

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)學院 ， 河南 鄭州 450046)

禽沙門菌病是一類重要的禽傳染病，可以造成幼雛大量死亡、蛋雞產(chǎn)蛋率下降、種蛋孵化率、出雛率下降，弱雛率增加，該病具有水平傳播和垂直傳播的特性，對家禽業(yè)危害巨大。該類病分為3種類型：雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒，對應的病原分別為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌，以及由雞白痢沙門菌與雞傷寒沙門菌之外的其他沙門菌。其中雞白痢沙門菌和禽傷寒沙門菌有宿主特異性，主要感染家禽，而禽副傷寒能廣泛感染各種動物和人，在自然界中家禽是其重要的貯存宿主。同時沙門菌也是世界上食源性腹瀉最常見的病原菌之一，在引起人類食源性腸胃炎的細菌中，沙門菌占第一或第二位[1]。

我國是抗菌藥物最大的生產(chǎn)和使用國?？咕幬镌陴B(yǎng)殖領域?qū)τ诜乐蝿游镆卟『吞岣唣B(yǎng)殖效益等方面發(fā)揮重要作用。但近年來細菌耐藥事件頻頻發(fā)生，細菌耐藥已成為一個嚴峻的全球性問題。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，是一種絲氨酸蛋白酶衍生物，能滅活三代頭孢菌素和氨曲南等β-內(nèi)酰胺類藥物，但對酶抑制劑、碳青霉烯類和頭霉烯類抗生素敏感，根據(jù)質(zhì)粒編碼基因和ESBLs優(yōu)先水解底物的不同可將其分為TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型等，其中以TEM、SHV、CTX-M型最為常見。本研究對河南某種雞場自帶孵化場在孵化后期死亡的雞胚進行調(diào)查，了解沙門菌在雞胚中的感染情況，并對所分離的沙門菌耐藥性和ESBLs基因進行檢測，分析ESBLs陽性菌株的耐藥表型與基因型的關系，為沙門菌的ESBLs分子流行特征的研究及有效防制禽沙門菌病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL-2 000，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；普通營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂，均購自北京奧博星有限責任公司；MH瓊脂，購自英國Oxoid公司；沙門菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；麥氏比濁管，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 藥敏紙片 試驗所用的藥敏紙片有氨基糖苷類的卡那霉素(K)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)，青霉素類的氨芐西林(AMP)，β內(nèi)酰胺抑制物類的阿莫西林克拉維酸(AMC)，頭孢菌素類的頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑林(KZ)、頭孢噻呋(EFT)，碳青霉烯類的美羅培南(MEM)、亞胺培南(IPM)，單環(huán)β內(nèi)酰胺類的氨曲南(ATM)，四環(huán)素類的四環(huán)素(TE)、土霉素(OT)，多肽類的多粘菌素B(PB)，酰胺醇類的氯霉素(C)，喹諾酮類的恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)，磺胺類的磺胺甲惡唑(SXT)、磺胺異惡唑(SF)，硝基呋喃類的呋喃妥因(F)，均購自英國Oxoid公司；頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸，頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸，均購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司。

1.3 標準菌株 大腸桿菌ATCC25922，雞白痢標準株C79-13，腸炎沙門菌標準株50041由揚州大學人獸共患病學江蘇省重點實驗室惠贈。

2 方法

2.1 細菌的分離與PCR鑒定 從河南省某父母代麻雞孵化場采集死胚共120份，無菌取雞胚肝臟、脾臟、卵黃液在S.S.瓊脂平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取疑似沙門菌菌落進行純化、培養(yǎng)；然后運用煮沸法提取細菌DNA，針對沙門菌腸毒素STN基因設計引物[2]進行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的細菌再用全自動細菌鑒定儀進一步鑒定。

2.2 血清型鑒定 將鑒定為陽性的沙門菌進行動力學試驗，以腸炎沙門菌和雞白痢標準株為對照，可知無動力的分離株為雞白痢或雞傷寒沙門菌，有動力的為禽副傷寒沙門菌，對于禽副傷寒沙門菌可通過玻片凝集法進行血清型分型，根據(jù)Kauffmann-White抗原表[3]檢索沙門菌分離株的血清型。以生理鹽水為陰性對照，排除自凝現(xiàn)象。

2.3 藥敏試驗 根據(jù)K-B紙片擴散法進行藥敏試驗,具體參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會 (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)手冊進行[4]，以E.coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，測定分離菌株的藥物敏感性。

2.4 產(chǎn)ESBLs菌株的篩選及確證試驗 參照藥敏試驗結(jié)果，篩選出抑菌圈直徑，頭孢他啶≤22 mm，氨曲南≤27 mm，頭孢曲松≤25 mm，3種藥物符合任意一種的菌株，然后對篩選出來的菌株，運用雙紙片協(xié)同測試法[5]，將頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸，頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸4個藥敏紙片貼于涂有待檢菌的MH瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 16～18 h后，測量抑菌圈直徑，兩個藥物中任何一個，在加克拉維酸后，抑菌圈直徑與不加克拉維酸時的抑菌圈直徑相比，增大值≥5 mm時，判定該菌產(chǎn)ESBLs。

2.5 ESBLs基因的PCR檢測 根據(jù)文獻上[6]已發(fā)表的沙門菌的12對ESBLs基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行BLSAT比對，確保引物序列正確無誤，分別合成了12對特異性引物。PCR反應體系20 μL，常規(guī)PCR反應條件，各個基因的退火溫度見表1，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。若與預期條帶大小一致即為陽性。將PCR陽性產(chǎn)物均送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將測序結(jié)果再次進行BLAST比對，確認所檢測的基因。

表1 PCR擴增反應條件及引物

3 結(jié)果

3.1 細菌分離鑒定結(jié)果 從120枚死胚共分離到55株沙門菌，分離率為45.83%；經(jīng)血清學鑒定，共有6種血清型(見表2)。

表2 55株沙門菌血清分型結(jié)果及其分離率

3.2 藥敏試驗結(jié)果 55株沙門菌分離株對磺胺異惡唑耐藥率最高(76.36%)，所有菌株對美羅培南、亞胺培南均敏感；對氯霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星較敏感(耐藥率1.82%)；且副傷寒沙門菌的耐藥情況明顯嚴重于雞白痢沙門菌，見表3。

表3 沙門菌藥敏試驗結(jié)果

由表4可以看出，55株沙門菌分離株的多重耐藥情況嚴重，最多可對八類15種抗菌藥物耐藥，其中二耐、三耐菌株的耐藥率為1.82%～20%，最為嚴重的是耐氨基糖苷類-青霉素類-頭孢類-磺胺類的四耐菌株，所占比例高達30.91%。

表4 沙門菌的耐藥譜

3.3 ESBLs菌株的耐藥情況及其基因的檢出情況 運用雙紙片協(xié)同法進行ESBLs篩選和確證試驗，結(jié)果表明，產(chǎn)ESBLs菌株為16株，陽性率(29.09%)較高，且ESBLs陽性菌株對氨基糖苷類、青霉素類、頭孢菌素類和磺胺類的耐藥率均為100%，其耐藥情況明顯嚴重于ESBLs陰性菌株，詳見表5。經(jīng)PCR擴增和測序、序列比對，16株ESBLs陽性菌株只檢出TEM一種耐藥基因，檢出率為100%，其余11種均未檢出。

4 討論

4.1 沙門菌的分離情況及耐藥性分析 試驗從某自帶孵化場的種雞場采集120個死胚，共分離鑒定出55株沙門菌，檢出率為45.83%，包含6種血清型，表明該場的沙門菌病流行嚴重且血清型復雜。其中雞白痢沙門菌25株，占45.45%；禽副傷寒沙門菌30株，占54.55%；副傷寒沙門菌不僅對雞只危害大，污染了雞肉、雞蛋后，對人的潛在威脅也很大，需要引起重視。

藥物的選擇性壓力是造成細菌耐藥的主要原因。雞場抗菌藥物的大量使用，使沙門菌的抗藥性日益嚴重。本研究中，分離的雞白痢沙門菌與禽副傷寒沙門菌均產(chǎn)生了較嚴重的耐藥性，但二者對不同藥物的耐藥程度不同。在21種藥物中，副傷寒沙門菌對9種藥物的耐藥率顯著超過雞白痢沙門菌，分別為卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢唑啉、磺胺甲惡唑、磺胺異惡唑，兩者間耐藥差異可能與副傷寒沙門菌的傳播宿主更廣泛，循環(huán)更復雜有關。本研究中所有沙門菌對四環(huán)素、土霉素的耐藥率不高，可能與用藥習慣的不同有關；對氨基糖苷類、青霉素類及磺胺異惡唑耐藥率較高，在51.85%～75.93%之間，臨床上應減少使用這些藥物，避免產(chǎn)生更加嚴重的耐藥性；對于畜禽禁止使用的氯霉素、氨曲南、美羅培南、亞胺培南耐藥率低，其中氯霉素是由于副作用過大，世界各國在所有食品動物上幾乎都已禁止使用，氨曲南、美羅培南、亞胺培南只允許在人醫(yī)上使用，在獸醫(yī)上為禁用藥。表明加強獸藥管理可以減少細菌耐藥性的產(chǎn)生。

表5 產(chǎn)ESBLs和不產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥情況的比較

4.2 ESBLs陽性菌株耐藥性分析及ESBLs基因流行特征 通過ESBLs的初篩和確證試驗可知，ESBLs陽性菌有16株，占分離總沙門菌株數(shù)量的29%，比楊玲報道的從豬肉中分離到的沙門氏菌中ESBLs陽性菌占17.46%高[7]。ESBLs陽性菌的耐藥情況明顯比ESBLs陰性菌嚴重，其中差別最大的是頭孢菌素類抗菌藥，除頭孢他啶外，ESBLs陽性菌對其他3種頭孢類的耐藥率為100%，而ESBLs陰性菌的耐藥率僅為5.13%，其次是青霉素類的氨芐西林，耐藥率相差50%左右，對其余β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率差異不明顯，且耐藥率均比較低，這些藥可能為該養(yǎng)殖場不常用的抗菌藥。ESBLs陽性菌株不僅對頭孢菌素類、青霉素類耐藥，還對氨基糖苷類、磺胺類交叉耐藥，對這四類藥物的多重耐藥率為100%；與有關文獻[8]報道的ESBLs陽性菌株往往表現(xiàn)為嚴重的多重耐藥性相符。ESBLs可水解碳青霉烯類以外的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，比如能水解青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類及β內(nèi)酰胺酶抑制物類，降低它們的療效；因此，即使體外藥敏試驗敏感，對于ESBLs陽性菌也不可使用青霉素、一、二、三代頭孢菌素、氨曲南和阿莫西林克拉維酸[9]。因此，在臨床用藥時，為了更加高效的治療疾病，需要藥敏試驗與ESBLs確證試驗相結(jié)合，合理選用抗菌藥物；同時，應注意臨床不能長期固定使用某幾種抗菌藥物，應交替輪換用藥；當一種藥物無效時不應更換使用同類藥物，以避免交叉耐藥。

動物源沙門菌中的ESBLs基因型眾多，在全球范圍內(nèi)流行，不同國家、地區(qū)的基因型流行特征存在差異。北美國家食品動物源性沙門菌以TEM和PSE型ESBLs基因為主，歐洲國家以CTX-M型為主，而中國則以TEM、CTX-M、CMY-2及OXA型為主，SHV型檢出率相對較低[10]。國內(nèi)報道的ESBLs基因流行特征的相關研究大多數(shù)為大腸桿菌的檢出情況，而本研究中16株ESBLs表型陽性的菌株均檢測出TEM (100%) ESBLs基因，其余11種ESBLs基因均未檢出，表明本場沙門菌ESBLs陽性菌株以TEM基因型為主。由于本次研究只調(diào)查了河南省一個麻雞種雞場，有一定的局限性，不能代表整個河南省沙門菌的耐藥情況及ESBLs基因的流行特征，但從此次調(diào)查可以看出，ESBLs陽性菌株檢出率較高，耐藥情況已十分嚴重，由于ESBLs可水解碳青霉烯類以外的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，有極強的耐藥性，且耐藥細菌可通過食物鏈傳播給人類，在臨床用藥時應謹慎用藥，切莫為了短期效益使用禁用獸藥，給人類帶來巨大威脅。

[1] Majowicz S E, Musto J, Scallan E,etal. International Collaboration on Enteric Disease “Burden of Illness” Studies. The global burden of nontyphoidal Salmonella gastroenteritis. Clin[J]. Infect Dis， 2010，50:882-889.

[2] 劉蓓蓓. 沙門菌 PCR 檢測方法的建立及其初步應用[D]. 揚州：揚州大學，2009：26-28.

[3] 朱超，許學斌.沙門菌屬血清型診斷[M].上海：同濟大學出版社, 2009：145-292.

[4] CLSL. M100-S25 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing [S]. Wayne，P A: Clinical and LaboratoryStandards Institute, 2015:44-60.

[5] 匡秀華. 華中地區(qū)三種畜禽病原菌耐藥和毒力的流行性及分子特征研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學, 2015:38-128.

[6] 楊玲, 江桂澤, 李灣,等. 屠宰場豬肉中產(chǎn)CTX-M沙門氏菌傳播分子特征[C]中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)藥理毒理學分會會員代表大會暨第十三次學術討論會與中國毒理學會獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會第五次學術研討會.2015:188-189.

[7] Livermore D M, Canton R, Gniadkowski M,etal. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2007, 59(2):165-174.

[8] 姜森, 張正, 楊朵,等. 2 062株大腸桿菌ESBL測定及耐藥分析[J]. 中國實驗診斷學, 2008, 12(9):1 134-1 136.

[9] 趙俊利, 石瑞麗, 李志芳,等. 內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛源致病性沙門氏菌耐藥性分析及ESBLs基因檢測[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2015, 42(8):2 150-2 159.