王 倩 ， 胥輝豪 ， 趙琳娜 ， 林珈好 ， 林德貴

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

二萜生物堿類化合物紫杉醇(TAX)是活性明確的天然抗癌藥物，在臨床上已廣泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分頭頸癌和肺癌的治療[1-5]。姜黃素(CUR)是從姜黃根莖中提取出的脂溶性酚類化合物，具有多種藥理活性，尤其抗腫瘤作用活性明確[6-8]。紫杉醇與姜黃素二者合用的體內(nèi)外抑癌作用優(yōu)于任一單成分組[9]，Hossain等[10]研究表明，姜黃素和紫杉醇合用能夠高效活化Caspase-8，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C、Smac/Diablo和AIF進(jìn)入腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。二者聯(lián)用可大大降低TAX用藥劑量，從而降低毒副作用。紫杉醇-姜黃素介孔SiO2/脂質(zhì)復(fù)合遞藥系統(tǒng)(PLMSNs)具有介孔SiO2比表面積大、裝載藥物多和緩釋等特性的同時(shí)，還具有脂質(zhì)體良好的生物相容性[11-12]。通過對紫杉醇和姜黃素同時(shí)載藥，發(fā)揮二者協(xié)同抗乳腺癌作用，提高二者載藥量、水溶性和穩(wěn)定性，從而提高其生物利用度，實(shí)現(xiàn)高效低毒。為了解自制TAX-CUR-PLMSNs在生理鹽水中的藥物釋放情況，結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)[13]進(jìn)行了如下試驗(yàn)。

1 主要試驗(yàn)材料與儀器

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品，姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，北京)；無水乙醇，乙腈，冰醋酸，甲酸，生理鹽水(北京化工廠，北京)；viskase MD34MM透析袋、封口夾(北京環(huán)科智儀科技有限公司，上海)；KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，北京)；Sigma 3-18K 臺式高速冷凍離心機(jī)(西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，上海)；德國默克密理博Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)(北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司，北京)；搖床ZHWY-1102C(上海智誠分析儀器制造有限公司，上海)；島津20A高效液相色譜儀(島津制作所，日本)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 HPLC同時(shí)檢測紫杉醇、姜黃素方法學(xué)建立 在篩選多種流動(dòng)相配比方案及洗脫方式后，確定色譜條件如下：色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A 相為乙腈，B 相為0.1%甲酸水溶液；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長: 227 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。分別繪制TAX和CUR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并從精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率等方面進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.2 溶解度考察 取紫杉醇和姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品配成過飽和溶液，于37 ℃、100 r/min條件下震蕩24 h后離心取上清過濾，高效液相色譜法檢測濃度。

2.3 增溶劑篩選 Robert[14]調(diào)研顯示,市售注射劑中吐溫-80的含量如下:肌肉注射≤ 4 %，靜脈推注≤0. 4 %,靜脈滴注≤ 2 %。十二烷基硫酸鈉(SDS)作為增溶劑其濃度亦不宜過高。因此以2%為濃度上限。分別制備濃度為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液，加入過量紫杉醇、姜黃素，一定條件下震蕩，離心取上清過濾，高效液相法檢測上清濃度。同樣的方法檢測同濃度梯度的吐溫-80對紫杉醇和姜黃素飽和濃度的影響。

2.4 體外釋藥

2.4.1 試驗(yàn)分組及藥物制備方法 TAX單藥組：稱取3 mg紫杉醇加入到含有10 mL 1.5%吐溫-80的生理鹽水中混勻；CUR單藥組：稱取30 mg姜黃素加入到含有10 mL 1.5%吐溫-80的生理鹽水中混勻；TAX+CUR單藥混合組：稱取3 mg紫杉醇與30 mg姜黃素加入到含有10 mL 1.5%吐溫-80的生理鹽水中混勻；TAX-CUR -MSNs組：稱取紫杉醇3 mg，姜黃素30 mg，于20 mL三氯甲烷溶液中混勻，避光，搖床振蕩19 h后離心，取上清檢測游離TAX、CUR的含量，沉淀置于通風(fēng)櫥；TAX-CUR -LMSNs組：稱取適量磷脂、膽固醇以及相應(yīng)劑量的紫杉醇或姜黃素加入圓底燒瓶中，無水乙醇溶解后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜。向TAX-CUR -MSNs組中裝有MSNs沉淀的離心管內(nèi)加入10 mL超純水，混勻后圓底燒瓶內(nèi)水合；TAX-CUR -PLMSNs組：在TAX-CUR -LMSNs組基礎(chǔ)上添加PEG-2 000成膜。

2.4.2 反透析法考察TAX-CUR-PLMSNs遞藥系統(tǒng)體外釋藥行為 研究微粒分散體系體外釋藥的方法主要分為四大類：膜擴(kuò)散技術(shù)、取樣與分離技術(shù)、原位法和連續(xù)流動(dòng)法[15]。本章通過經(jīng)膜擴(kuò)散技術(shù)及取樣與分離技術(shù)對自制遞藥系統(tǒng)的體外釋放進(jìn)行研究。采用反透析法進(jìn)行體外釋藥試驗(yàn)。半透膜煮沸后加入5 mL釋放介質(zhì)，兩端封閉。250 mL 釋放容器中加入100 mL釋放介質(zhì)(4組、5組和6組)加入新制備好的3 mL藥物，混勻后加入封閉好的半透膜。搖床內(nèi)震蕩，37 ℃，100 r/min。分別于以下時(shí)間點(diǎn)取袋內(nèi)溶液1 mL過濾后高效液相法檢測濃度：0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h。取樣后即刻補(bǔ)充等量釋放介質(zhì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC法同時(shí)檢測紫杉醇、姜黃素方法學(xué)結(jié)果與分析 在2.1所述色譜條件下，紫杉醇在0.6 μg/mL-15 μg/mL 濃度范圍內(nèi)回歸方程(n=5)為：A = 44018C- 5069.7，R2= 0.9998，15 μg/mL-600 μg/mL濃度范圍內(nèi)回歸方程(n=5)為：A = 39175C + 190612，R2= 0.9998。姜黃素在1.5 μg/mL-30 μg/mL 濃度范圍內(nèi)回歸方程(n=5)為：A = 44698C-6311.9，R2= 0.9993，15 μg/mL-600 μg/mL濃度范圍內(nèi)回歸方程(n=5)為：A = 53627C - 215933，R2= 1.0000。所有濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。該HPLC 方法檢測紫杉醇、姜黃素，其精密度/重復(fù)性(紫杉醇R2=0.81%，姜黃素R2=0.41%)；28 h內(nèi)穩(wěn)定性(紫杉醇R2=0.8895%，姜黃素R2=0.8808%)及回收率(紫杉醇高中低3個(gè)濃度的R2分別為0.87%、1.03%、1.29%，姜黃素高中低3個(gè)濃度的R2分別為1.05%、1.85%、1.89%)均符合相關(guān)要求。綜上，建立了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性良好且可重復(fù)的同時(shí)檢測紫杉醇、姜黃素濃度的高效液相法。

3.2 溶解度考察結(jié)果與分析 紫杉醇、姜黃素二者濃度均低于高效液相色譜的最低檢測限0.6 μg/mL。說明紫杉醇和姜黃素在生理鹽水中溶解度極低，不適合單獨(dú)用于體外釋藥試驗(yàn)。

3.3 增溶劑篩選結(jié)果與分析 見表1。

表1 不同濃度SDS和吐溫-80對紫杉醇和姜黃素飽和濃度的影響

從表1可以看出， SDS對紫杉醇的增溶效果顯著優(yōu)于吐溫-80，但是對于姜黃素增溶效果不及吐溫-80；本課題組已經(jīng)通過細(xì)胞試驗(yàn)確定姜黃素、紫杉醇最佳協(xié)同劑量比為6∶1，從增溶劑篩選結(jié)果可知吐溫-80濃度為1.5%時(shí)可以達(dá)到該條件，同時(shí)又能滿足體外釋藥的漏槽條件。

3.4 體外釋藥試驗(yàn)結(jié)果與分析 計(jì)算每個(gè)取藥時(shí)間點(diǎn)的累積釋藥濃度并繪制曲線，結(jié)果見圖1、圖2。

兩種藥物釋藥行為共同之處主要包括以下兩個(gè)方面：第一，單藥組累積釋藥量高于混合組；第二，自制遞藥系統(tǒng)累積釋藥量高于裸藥組。將遞藥系統(tǒng)中的紫杉醇、姜黃素釋放曲線分別用數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果見表2。

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)紫杉醇的累積釋藥 曲線 (n=3)

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)姜黃素的累積釋藥曲線 (n=3)

表2 PLMSNs組紫杉醇累積釋放率動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果

表3 PLMSNs組姜黃素累積釋放率動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果

遞藥系統(tǒng)中的紫杉醇和姜黃素兩個(gè)指標(biāo)成分的Hixon-Crowell模型擬合釋放曲線如圖3。

圖3 PLMSNs組紫杉醇Hixon-Crowell模型釋放曲線

圖4 PLMSNs組姜黃素Hixon-Crowell模型釋放曲線

由圖3、圖4模型擬合釋放曲線可知，紫杉醇-姜黃素介孔SiO2/脂質(zhì)復(fù)合遞藥系統(tǒng)中的紫杉醇和姜黃素釋藥行為均與Hixon-Crowell 模型擬合程度最高，相關(guān)系數(shù) R2均大于 0.99。

4 結(jié)果與討論

吐溫-80是一種非離子型表面活性劑，其增溶效果歸因于其能在水中形成膠團(tuán)(膠束)[16-17]。作為增溶劑可以提高紫杉醇和姜黃素在生理鹽水中的溶解度，但是裸藥組藥物進(jìn)入搖床震蕩時(shí)大部分以被吐溫膠束包裹的形式均勻分布于釋放介質(zhì)中，整個(gè)過程中只有少量藥物從釋放介質(zhì)中穿過透析袋進(jìn)入到袋內(nèi)，由此檢測到的藥物濃度比較低，對應(yīng)的釋放速度和累積釋放量也較低。

由此可推測自制遞藥系統(tǒng)中的紫杉醇和姜黃素緩慢從介孔二氧化硅載體釋出經(jīng)過釋放介質(zhì)穿過透析袋進(jìn)入袋內(nèi)介質(zhì)中。兩種藥物釋藥行為不同之處主要在于3種遞藥系統(tǒng)之間的差別。紫杉醇累積釋藥量由高到低分別為：MSNs>PLMSNs>LMSNs，姜黃素累積釋藥量由高到低分別為：LMSNs>PLMSNs>MSNs。其中針對紫杉醇而言，MSNs表面沒有包被任何物質(zhì)，紫杉醇從孔道內(nèi)逐漸釋放，沒有受到來自磷脂層或PEG-2000的阻礙作用，因此釋藥量高于PLMSNs組和LMSNs組。PLMSNs藥物表面PEG-2000作為一種親水性基團(tuán)有利于釋放介質(zhì)進(jìn)入孔道中，促進(jìn)藥物的釋放。針對姜黃素，MSNs表面沒有包被任何物質(zhì)，姜黃素從孔道內(nèi)逐漸釋放，雖未受到來自磷脂層或PEG-2000的阻礙作用，但是姜黃素初始劑量大，被吐溫-80所形成的膠團(tuán)包裹在內(nèi)部，因此檢測到的濃度低于LMSNs組和PLMSNs組。PLMSNs表面的PEG-2000水溶性促進(jìn)效果不及電荷效應(yīng)對姜黃素釋出的影響。

整體來看紫杉醇和姜黃素的體外釋放行為，紫杉醇的釋放量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于姜黃素，這與兩者的結(jié)構(gòu)特性及其與釋放介質(zhì)的不同作用有關(guān)。

5 結(jié)論

紫杉醇-姜黃素介孔 SiO2/脂質(zhì)復(fù)合遞藥系統(tǒng)中紫杉醇和姜黃素的釋放行為符合溶蝕作用控制的多成分均衡釋放模式[16]，成分之間相輔相成、相互協(xié)調(diào)，體現(xiàn)了其整體釋放行為。

[1] 史清文. 天然藥物化學(xué)史話:紫杉醇[J]. 中草藥,2011,42(10):1 878-1 884.

[2] Aigner J, Marme F, Smetanay K,etal. Nab-PacliTAXel monotherapy as a treatment of patients with metastatic breast cancer in routine clinical practice[J]. Anticancer Res, 2013,33(8):3 407-3 413.

[3] Gluck S. nab-PacliTAXel for the treatment of aggressive metastatic breast cancer[J]. Clin Breast Cancer, 2014,14(4):221-227.

[4] Gou Q, Lei L, Wang C,etal. Polymeric nanoassemblies entrapping curcumin overcome multidrug resistance in ovarian cancer[J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2015, 126: 26-34.

[5] Gao X, Wang B, Wu Q,etal. Combined delivery and Anti-cancer cctivity of paclitaxel and curcumin using polymeric micelles[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology, 2015, 11(4):578-589.

[6] 馮為, 胡林峰. 姜黃素的研究進(jìn)展及其抗腫瘤作用概況[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用, 2011(13):117-118.

[7] Kunnumakkara A B, Diagaradjane P, Anand P,etal. CURcumin sensitizes human colorectal cancer to capecitabine by modulation of cyclin D1, COX-2, MMP-9, VEGF and CXCR4 expression in an orthotopic mouse model[J]. Int J Cancer, 2009,125(9):2 187-2 197.

[8] Bayet-Robert M, Kwiatkowski F, Leheurteur M,etal. Phase I dose escalation trial of doceTAXel plus CURcumin in patients with advanced and metastatic breast cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2010,9(1):8-14.

[9] Gao X, Wang B, Wu Q,etal. Combined Delivery and Anti-Cancer Activity of PacliTAXel and CURcumin Using Polymeric Micelles[J]. J Biomed Nanotechnol, 2015,11(4):578-589.

[10] Hossain M, Banik N L, Ray S K. Synergistic anti-cancer mechanisms of CURcumin and pacliTAXel for growth inhibition of human brain tumor stem cells and LN18 and U138MG cells[J]. Neurochem Int, 2012,61(7):1 102-1 113.

[11] Rahimi Hamid Reza,Nedaeinia Reza,Sepehri Shamloo Alireza,etat. Novel delivery system for natural products: Nano-curcumin formulations[J]. Avicenna journal of phytomedicine,2016,64.

[12] Liu, Z. Evaluation of the efficacy of paclitaxel with curcumin combination in ovarian cancer cells[J]. Oncol Lett, 2016, 12(5): 3 944-3 948.

[13] 王扣瓊, 邵文琦, 彭穎斐, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血漿紫杉醇性能評價(jià)[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2016(05):394-398.

[14] Strickley R G. Solubilizing excipients in oral and injectable formulations[J]. Pharm Res, 2004,21(2):201-230.

[15] Pedram Rafiei,Azita Haddadi. Pharmacokinetic Consequences of PLGA Nanoparticles in DoceTAXel Drug Delivery[J]. Pharmaceutical Nanotechnology,2017,51.

[16] 孫會敏,楊銳,欒琳,等. 聚山梨酯80質(zhì)量分析與致敏原探究[J]. 藥物分析雜志,2011,31(10):1 850-1 855.

[17] 吳毅,金少鴻. 藥用輔料吐溫 80的藥理、藥動(dòng)學(xué)及分析方法研究進(jìn)展[J]. 中國藥事,2008,22(08):717-720.