孔德柱++張樹(shù)峰++周玉生+郝亞峰

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.143

摘要：為了研究固氮魚(yú)腥藻Anabaena Azotica 119作為未來(lái)生物肥料的可能性，分別以小麥和西紅柿為目標(biāo)作物，設(shè)計(jì)了藻肥、尿素和羊糞的肥效對(duì)比試驗(yàn)和藻肥改善土壤氮含量試驗(yàn)。結(jié)果顯示：生長(zhǎng)50 d的小麥，藻肥組鮮質(zhì)量為33.7 g，是對(duì)照組的3倍；干質(zhì)量為10.4 g，是對(duì)照組的2倍。生長(zhǎng)50 d的西紅柿，藻肥組的鮮質(zhì)量為87.7 g，是空白對(duì)照的15倍，是羊糞和尿素的2倍還多；藻肥組干質(zhì)量為11.4 g，是空白對(duì)照組的14倍。施用藻肥的土壤在90 d后，含氮量可以提高416%，維持在0.075%左右。固氮魚(yú)腥藻在土壤中能夠持續(xù)固定空氣中的氮?dú)猓型_(kāi)發(fā)成為環(huán)境友好、肥效持久的生物肥料。

關(guān)鍵詞：固氮魚(yú)腥藻；肥效；土壤氮含量；生物肥料

中圖分類號(hào)： S142+.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0499-03

收稿日期：2015-11-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部國(guó)際合作項(xiàng)目（編號(hào)：2011DFA32640）。

作者簡(jiǎn)介：孔德柱（1984—），男，黑龍江綏化人，碩士，工程師，主要從事生物質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域項(xiàng)目開(kāi)發(fā)。Tel：（010）56632598；E-mail：kongdezhukong@163.com。固氮藍(lán)藻是一類低等原核植物，能固定空氣中分子態(tài)氮成為氮素化合物[1]。很早以前人們就發(fā)現(xiàn)了藻類對(duì)植物具有肥效作用[2-3]。1939年人們發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在稻田的固氮藍(lán)藻可以使水稻連年保持較高的產(chǎn)量[4]。John研究了藍(lán)藻作為肥料固氮的能力，并在開(kāi)放池中進(jìn)行了藍(lán)藻培育[5]，但沒(méi)有對(duì)后續(xù)的肥效做進(jìn)一步研究。夏建明等研究了固氮藍(lán)藻對(duì)稻田的肥效作用，無(wú)論是干藻還是鮮藻，施用于水稻后，水稻的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相比于對(duì)照都有明顯的提高[6]。Mohmmed等用豌豆對(duì)藍(lán)藻肥料進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻肥料配合化肥施用后豌豆的生長(zhǎng)效果更好，甚至可以用藍(lán)藻肥料代替一半的化肥[7]。但到目前為止，對(duì)藍(lán)藻肥料的研究并不系統(tǒng)，藍(lán)藻作為肥料也多見(jiàn)于在水稻上的應(yīng)用[8-9]，在其他作物的應(yīng)用仍鮮有報(bào)道。本研究基于對(duì)現(xiàn)有尿素等氮肥生產(chǎn)能耗高、環(huán)境污染大[10]、對(duì)土壤有害[11]等弊端，研究了固氮藍(lán)藻作為氮肥對(duì)小麥和西紅柿的肥效及對(duì)土壤氮含量的改善，希望能在未來(lái)開(kāi)發(fā)出一種環(huán)境友好、肥效持久的生物肥料。

1材料與方法

1.1藻種

固氮魚(yú)腥藻Anabaena azotica 119，由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所提供，篩選分離自庫(kù)布其地區(qū)土壤。

1.2藻種培養(yǎng)基

采用BG11缺氮培養(yǎng)基。

1.3培養(yǎng)條件

在恒溫光照搖床中培養(yǎng)，光照：60 000～80 000 lx；光暗周期12 h—12 h；溫度：28 ℃；搖床轉(zhuǎn)速：150 r/min。培養(yǎng)基pH值：7.0～7.5；選擇1 L錐形瓶，每瓶裝液量0.5 L。

1.4固氮魚(yú)腥藻119顯微鏡觀察

用滴管吸取培養(yǎng)7 d的固氮魚(yú)腥藻119培養(yǎng)液，滴入事先準(zhǔn)備好的載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，選擇10倍目鏡和40倍物鏡觀察。

1.5固氮魚(yú)腥藻119生長(zhǎng)曲線測(cè)定

固氮魚(yú)腥藻在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)分泌多糖而出現(xiàn)藻之間團(tuán)聚和貼壁現(xiàn)象，所以D值和細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究藻的生長(zhǎng)狀況并不適合。所以本研究采用如下方法測(cè)定其生長(zhǎng)曲線：取1 L錐形瓶15個(gè)，洗凈，烘干，稱量，記錄瓶質(zhì)量。每瓶中加入 500 mL 培養(yǎng)基，接種量10%，放入光照搖床中培養(yǎng)，每2 d取樣，70 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量。

1.6固氮魚(yú)腥藻氮含量測(cè)定

委托中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所檢測(cè)。

1.7小麥和西紅柿肥效試驗(yàn)

選擇庫(kù)布其當(dāng)?shù)厣惩裂b于直徑為18 cm的花盆中，分別以小麥和西紅柿為目標(biāo)作物，施肥量以200 kg/hm2純氮[12-13]為基準(zhǔn)換算，每個(gè)花盆施用純氮0.5 g。尿素組：每個(gè)花盆施用尿素1.1 g；羊糞組：羊糞含氮量為2.3%[14]，每個(gè)花盆施用羊糞21.7 g。藻肥組：需要累積施用干藻7 g，用培養(yǎng)22 d成熟的固氮魚(yú)腥藻119藻液，藻液含藻量 0.7 g/L，濃縮5倍，對(duì)植物進(jìn)行澆灌，每次澆灌1 L，澆灌2次（中間相隔 3 d），尿素組和對(duì)照組用等量水澆灌。之后，對(duì)所有盆栽澆灌清水，每周2次，每次500 mL，生長(zhǎng)時(shí)間為50 d。

1.8小麥、西紅柿干質(zhì)量、鮮質(zhì)量測(cè)定

取500 mL燒杯，洗凈、烘干、稱量，記錄杯質(zhì)量。剪取盆栽中生長(zhǎng)50 d的小麥或西紅柿地上部分的全部生物質(zhì)，分別放入事先準(zhǔn)備好的燒杯中，稱質(zhì)量，計(jì)算出質(zhì)量差，為小麥或西紅柿的鮮質(zhì)量。把盛有小麥或西紅柿的燒杯放入烘箱中，70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，計(jì)算出質(zhì)量差，為小麥或西紅柿的干質(zhì)量。

1.9土壤氮含量測(cè)定

土壤氮含量采用半微量開(kāi)氏法[15]測(cè)定。1.10藍(lán)藻和尿素肥料對(duì)土壤含氮量影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選擇的庫(kù)布其當(dāng)?shù)氐纳惩?，土壤含氮?.017%。取直徑18 cm花盆，處理方法同“1.7”節(jié)中的尿素組和藻肥組。按時(shí)分別取尿素組和藻肥組花盆中2 cm深度的沙土，測(cè)定其土壤的總氮含量，測(cè)定方法見(jiàn)“1.9”節(jié)。

2結(jié)果與分析

2.1固氮魚(yú)腥藻119形態(tài)觀察

圖1是固氮魚(yú)腥藻119培養(yǎng)7 d后的光學(xué)顯微鏡照片。從照片可以看出：固氮魚(yú)腥藻119菌絲單一，細(xì)胞呈球形或圓柱形，異形固氮細(xì)胞明顯。異形細(xì)胞是藍(lán)藻固氮的場(chǎng)所[1]，藍(lán)藻在缺氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，自身需要的氮全部來(lái)自異形細(xì)胞固定大氣中的氮?dú)?。培養(yǎng)22 d的固氮魚(yú)腥藻119含氮量為 7.2%（干質(zhì)量）。

2.2固氮魚(yú)腥藻119生長(zhǎng)規(guī)律

固氮魚(yú)腥藻119生長(zhǎng)速度較慢，需要22～24 d進(jìn)入成熟期（圖2）。該藻在生長(zhǎng)過(guò)程中伴隨大量胞外多糖產(chǎn)生，并團(tuán)聚在一起。當(dāng)該藻種作為肥料施用到土壤中，胞外多糖有助于細(xì)胞適應(yīng)外部環(huán)境，進(jìn)一步在土壤中繁殖。肥效試驗(yàn)所用的藍(lán)藻肥料是培養(yǎng)22 d的固氮魚(yú)腥藻119，此時(shí)該藻種活性和生物量都比較高，作為藻肥的藍(lán)藻含氮量為7.2%（干質(zhì)量），培養(yǎng)22 d的生物量為0.7 g/L。

2.3固氮魚(yú)腥藻119作為生物肥料在小麥上的肥效

藍(lán)藻肥料澆灌后，會(huì)在土壤表面形成聚集，1周后會(huì)形成藍(lán)綠色的結(jié)皮，藻種會(huì)在土壤中繼續(xù)生長(zhǎng)固定空氣中的氮?dú)?，持續(xù)提供給小麥作物肥料。

從圖3中可以看出，50 d后，加入藍(lán)藻肥料的小麥更加茂密，顏色相對(duì)更綠，葉片較寬，基本沒(méi)有黃葉；對(duì)照組生長(zhǎng)較慢，葉子很窄，顏色偏黃綠，植株很小；尿素組枯葉較多，植株已經(jīng)抽穗。從整個(gè)試驗(yàn)來(lái)看，由于沙土肥力很差，15 d后對(duì)照基本停止生長(zhǎng)；施用尿素化肥的小麥在前半個(gè)月相比于對(duì)照和藍(lán)藻肥料生長(zhǎng)迅速，隨著肥力匱乏，到后期黃葉增多，40 d 后開(kāi)始抽穗。藍(lán)藻肥料施用后半個(gè)月內(nèi)，相比于對(duì)照組差異不大。但半個(gè)月后肥效開(kāi)始明顯體現(xiàn)。藍(lán)藻肥料特點(diǎn)為肥效比較緩慢，施用后期效果明顯，且肥力持久。原因在于藍(lán)藻固氮在細(xì)胞體內(nèi)完成，對(duì)作物供氮需要藍(lán)藻細(xì)胞死亡釋放或代謝釋放，所以比較緩慢。藍(lán)藻施用到土壤中后，部分藻體可以持續(xù)存活并利用光能繼續(xù)繁殖，體現(xiàn)到作物上表現(xiàn)為持久的肥效。

從圖4小麥試驗(yàn)的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量對(duì)比可以看出，固氮魚(yú)腥藻肥料明顯優(yōu)于不施加肥料的對(duì)照組，鮮質(zhì)量為33.7 g，是對(duì)照組的3倍，干質(zhì)量為10.4 g，是對(duì)照組的2倍。藍(lán)藻肥料相比于尿素，鮮質(zhì)量和干質(zhì)量略低，從生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)看，如果延長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)間，藍(lán)藻肥料更有優(yōu)勢(shì)。對(duì)于小麥來(lái)說(shuō)，固氮魚(yú)腥藻是非常好的生物肥料，基本可以代替氮肥尿素。

2.4固氮魚(yú)腥藻119作為生物肥料在西紅柿上的肥效

固氮魚(yú)腥藻肥料在西紅柿上的表現(xiàn)更為突出。從圖5可以看出，施用藍(lán)藻肥料的西紅柿植株明顯高于對(duì)照組和羊糞組，與尿素組高度相當(dāng)，但枝多葉茂，更加粗壯。西紅柿等果實(shí)類作物，在生長(zhǎng)周期中需要更多的肥料。一般種植過(guò)程中多采用農(nóng)家肥和化肥混合且多次施用。在沒(méi)有肥料的情況下，西紅柿秧苗生長(zhǎng)基本停滯；尿素組在移栽后1個(gè)月內(nèi)一直長(zhǎng)勢(shì)迅猛，后期開(kāi)始乏力，秧苗較細(xì)；羊糞和藍(lán)藻組前期肥效都較慢，半個(gè)月后開(kāi)始快速生長(zhǎng)，羊糞組40 d后高度不再增加，而藻肥組持續(xù)生長(zhǎng)，肥效非常顯著。

圖6是對(duì)西紅柿鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的對(duì)比，施加藍(lán)藻肥料的西紅柿鮮質(zhì)量為87.7 g，是空白對(duì)照的15倍，是羊糞和尿素的2倍還多；藍(lán)藻肥料組干質(zhì)量為11.4 g，是空白對(duì)照組的14倍。說(shuō)明藍(lán)藻肥料對(duì)于改良沙漠土壤效果十分明顯。固氮魚(yú)腥藻肥料在西紅柿中的表現(xiàn)完全優(yōu)于尿素和羊糞，可以代替現(xiàn)有的化學(xué)肥料。

2.5固氮魚(yú)腥藻肥料對(duì)土壤含氮量的影響

從圖7可以看出，尿素剛施入土壤中，土壤含氮量較高，達(dá)到0.083%，但之后迅速下降，3 d后下降到0.064%，6 d 后下降到0.055%。尿素剛施入土壤中氮含量較高，主要以水徑流和氣體揮發(fā)的形式損失[10]。之后土壤中氮含量下降緩慢。而固氮藍(lán)藻肥料相反，在剛施用階段土壤氮含量很低，只有0.023%，之后開(kāi)始逐漸增加，到30 d土壤氮含量達(dá)到0066%，增速開(kāi)始變緩，60 d后達(dá)到平衡點(diǎn)，氮含量為 0.073%。

“2.3”節(jié)試驗(yàn)結(jié)果顯示，施用藍(lán)藻肥料的小麥15 d內(nèi)與對(duì)照組表現(xiàn)差別不大，原因在于藍(lán)藻施用15 d內(nèi)，土壤中的氮含量沒(méi)有很大改善。15 d后，施用藻肥的土壤氮含量快速增加，小麥開(kāi)始快速生長(zhǎng)?！?.3”節(jié)和“2.4”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果都與本節(jié)試驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合。

施用藍(lán)藻肥料的土壤在90 d后，土壤含氮量可以維持在0.075%左右，而施用尿素的土壤在90 d后，土壤含氮量基本回到最初的水平。在本試驗(yàn)選用的沙土中，施用藍(lán)藻肥料 90 d 后，土壤含氮量提高416%。

3結(jié)論與討論

固氮魚(yú)腥藻119在BG11缺氮培養(yǎng)基中22～24 d進(jìn)入生長(zhǎng)成熟期。成熟期的藻液可以直接或濃縮后作為肥料施用的土壤中，該藻可以在土壤中持續(xù)存活并生長(zhǎng)，并不斷固定空氣中的氮?dú)?，作為氮肥分泌到土壤中?/p>

固氮魚(yú)腥藻肥料肥效比較緩慢，但十分持久。該肥料使用后15 d內(nèi)幾乎沒(méi)有效果，但15 d后作物生長(zhǎng)好轉(zhuǎn)。生長(zhǎng) 50 d 的小麥，藍(lán)藻肥料組鮮質(zhì)量是對(duì)照組的3倍，干質(zhì)量是對(duì)照組的2倍。生長(zhǎng)50 d的西紅柿，藍(lán)藻肥組料的鮮質(zhì)量為87.7 g，是空白對(duì)照的15倍，是羊糞和尿素的2倍還多；藍(lán)藻肥料組干質(zhì)量為11.4 g，是空白對(duì)照組的14倍。藍(lán)藻肥料不僅可以應(yīng)用在稻田中，在沙地中仍然有優(yōu)良的表現(xiàn)。驗(yàn)證藍(lán)藻的田間肥效試驗(yàn)，如何形成有效的藍(lán)藻養(yǎng)殖施肥模式和經(jīng)濟(jì)效益分析等方面，需要進(jìn)一步研究。

施用藍(lán)藻肥料的土壤在90 d后，土壤含氮量可以維持在0.075%左右，而施用尿素的土壤在90 d后，土壤含氮量基本回到原始土壤含氮量水平。在本試驗(yàn)選用的沙土中，施用藍(lán)藻肥料90 d后，土壤含氮量提高416%。該藻在土壤中的生長(zhǎng)繁殖固氮規(guī)律和對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)等方面的影響還有待進(jìn)一步研究。

我國(guó)尿素化肥的利用率只有30%～40%，且對(duì)土壤和環(huán)境都有很大的負(fù)面作用[10]。藍(lán)藻肥料不但可以提供植物生長(zhǎng)所需要的氮肥，而且能夠保持土壤含氮量長(zhǎng)期保持較高水平，未來(lái)應(yīng)用前景廣闊。

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