左勇++江鵬+++葉碧霞++王小龍++傅彬++楊小龍++張晶

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.131

摘要：研究了1株產(chǎn)藍(lán)色素的鏈霉菌D2013的發(fā)酵條件。在單因素試驗(yàn)（發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、起始pH值、裝液量等因素）的基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果表明，鏈霉菌D2013產(chǎn)藍(lán)色素的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL、起始pH值為7.6，在此條件下，藍(lán)色素的產(chǎn)量可達(dá) 74.8 U/mL。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌；藍(lán)色素；發(fā)酵；正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)： TQ920.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0455-03

收稿日期：2015-08-17

基金項(xiàng)目：四川省教育廳成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（編號(hào)：11ZZ016）。

作者簡(jiǎn)介：左勇（1972—），男，重慶萬(wàn)州人，碩士，教授，主要從事食品工程方面的研究。E-mail：sgzuoyong@tom.com。目前，隨著合成色素在食品和化妝品等領(lǐng)域引起的安全問(wèn)題不斷被報(bào)道，以及對(duì)合成色素毒性認(rèn)識(shí)的不斷加深，許多合成色素已被禁止用于食品、化妝品等領(lǐng)域，使得相關(guān)企業(yè)不得不尋求無(wú)毒或低毒的色素代替 “有毒色素”的應(yīng)用。

天然色素具有無(wú)毒、無(wú)害及對(duì)人體有益等優(yōu)點(diǎn)[1]，將逐步取代合成色素的應(yīng)用?，F(xiàn)在，市場(chǎng)對(duì)天然色素的需求逐漸增大，如何獲得大量的天然色素以滿足市場(chǎng)需求已成為色素領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。微生物色素作為一種天然色素，不僅具有天然色素的著色功能，大多數(shù)微生物色素還具有保健價(jià)值和藥用價(jià)值[2-7]。另外，微生物色素的生產(chǎn)不受資源、季節(jié)等的限制，制取工藝簡(jiǎn)單，成本相對(duì)較低，必將成為天然色素的主要來(lái)源之一。目前，利用微生物生產(chǎn)的天然色素種類(lèi)較多、色系較齊[8-10]，但通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)的天然藍(lán)色素卻十分罕見(jiàn)[11-12]，因此研究微生物發(fā)酵產(chǎn)藍(lán)色素有重要的研究?jī)r(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)以鏈霉菌D2013為試驗(yàn)菌株，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)藍(lán)色素的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該菌株產(chǎn)藍(lán)色素提供基礎(chǔ)研究。

1材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

1.1.1菌種鏈霉菌D2013，來(lái)源于四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基[13]。

1.2主要儀器與設(shè)備

SKY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司），GZ-250-HSⅡ恒溫恒濕培養(yǎng)箱（韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司），UV759S紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海宜有電子科技有限公司）。

1.3種子的制備

挑取適量鏈霉菌D2013孢子，接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)24 h后，作為種子。

1.4藍(lán)色素產(chǎn)量的測(cè)定方法[12]

（1）藍(lán)色素相對(duì)效價(jià)單位定義：1 mL發(fā)酵液所提取的藍(lán)色素，在pH值為9.0及在576 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，將D值0.1定義為1個(gè)色素效價(jià)相對(duì)單位（U/mL），簡(jiǎn)稱色價(jià)。

（2）藍(lán)色素產(chǎn)量的測(cè)定方法：將發(fā)酵液以8 000 r/min離心10 min后取上清。調(diào)pH值至9.0，再用pH值為9.0的水溶液定容至原發(fā)酵體積，測(cè)定D576 nm值，計(jì)算色價(jià)。本研究所測(cè)色素為胞外藍(lán)色素。

1.5發(fā)酵條件的研究[14-17]

本試驗(yàn)以高氏1號(hào)培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基。通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、裝液量、接種量和發(fā)酵起始pH值等因素對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵溫度對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

在接種量為10%、發(fā)酵起始pH值為7.2、發(fā)酵時(shí)間為 9 d、裝液量為100 mL/250 mL的條件下，發(fā)酵溫度分別控制為 21、24、27、30、33、36、39 ℃，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，發(fā)酵溫度在21～30 ℃內(nèi)，藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，藍(lán)色素的產(chǎn)量最高；發(fā)酵溫度超過(guò)30 ℃后，藍(lán)色素的產(chǎn)量明顯下降。原因可能是溫度不但影響鏈霉菌的生長(zhǎng)和代謝途徑，同時(shí)還可能影響發(fā)酵培養(yǎng)基的理化性質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)濃度、pH值等）及所產(chǎn)藍(lán)色素的穩(wěn)定性，故發(fā)酵的最適溫度為30 ℃。

2.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

在發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵起始pH值為7.2、接種量為10%、裝液量為100 mL/250 mL的條件下，發(fā)酵時(shí)間分別控制為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間在2～8 d內(nèi)，藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 d時(shí)，藍(lán)色素的產(chǎn)量最高；發(fā)酵時(shí)間超過(guò)8 d后，藍(lán)色素的產(chǎn)量不但沒(méi)有增加，反而有下降的趨勢(shì)。原因在于發(fā)酵的前期，藍(lán)色素的產(chǎn)量與鏈霉菌生長(zhǎng)有關(guān)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加藍(lán)色素的產(chǎn)量不斷增加；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在發(fā)酵的后期，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗，菌體不再產(chǎn)藍(lán)色素，代謝產(chǎn)生的藍(lán)色素可能在自身酶的作用下發(fā)生降解或轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)，從而使藍(lán)色素產(chǎn)量減少，故最適發(fā)酵時(shí)間確定為8 d。

2.3接種量對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

在發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵起始pH值為7.2、發(fā)酵時(shí)間為9 d、裝液量為100 mL/250 mL的條件下，接種量分別控制為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，接種量在2%～8%內(nèi)，藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著接種量的增大而增加；當(dāng)接種量為8%時(shí)，藍(lán)色素的產(chǎn)量最高；接種量超過(guò)8%后藍(lán)色素的產(chǎn)量顯著下降。原因在于，接種量的大小將決定微生物的生長(zhǎng)繁殖速度，會(huì)影響代謝產(chǎn)物的生成[15]；接種量過(guò)小，菌體的調(diào)整期長(zhǎng)，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，影響發(fā)酵效率；接種量過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，培養(yǎng)液的理化因子變化快，不利于藍(lán)色素產(chǎn)生，故最適接種量應(yīng)為8%。

2.4裝液量對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

在250 mL的搖瓶中，裝液量分別為20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mL的條件下，接種量控制為10%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵起始pH值為7.2、發(fā)酵時(shí)間9 d，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，裝液量在20～100 mL內(nèi)，藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著裝液量的增加而增加；當(dāng)搖瓶裝液量為100 mL時(shí)，藍(lán)色素的產(chǎn)量最高；裝液量超過(guò)100 mL后，藍(lán)色素的產(chǎn)量有下降的趨勢(shì)。這是由于裝液量少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量少、發(fā)酵容積小，影響了藍(lán)色素的產(chǎn)量；然而隨著裝液量的增加，溶氧量減小，不利于藍(lán)色素的產(chǎn)生；故在250 mL的搖瓶中，發(fā)酵的最佳裝液量為100 mL。

2.5發(fā)酵起始pH值對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

在接種量為10%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為9 d、裝液量為100 mL/250 mL的條件下，將發(fā)酵起始 pH值 分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，發(fā)酵起始pH值在5.0～7.6內(nèi)，藍(lán)色素產(chǎn)量隨pH值增大而增加；當(dāng)pH值為7.6時(shí)，藍(lán)色素的產(chǎn)量最高；pH值超過(guò)7.6后，藍(lán)色素的產(chǎn)量明顯下降。這是由于pH值不僅可以影響鏈霉菌的生長(zhǎng)，還可能影響藍(lán)色素的穩(wěn)定性；pH值會(huì)影響菌株代謝所需酶的活性，pH值過(guò)低或過(guò)高都不利于菌體生長(zhǎng)，從而影響藍(lán)色素的產(chǎn)量，故發(fā)酵的最適起始pH值為7.6。

2.6正交試驗(yàn)

在單因素研究結(jié)果基礎(chǔ)上，按表1安排5因素4水平的正交試驗(yàn)[18]，優(yōu)化發(fā)酵條件。

由表2可知，5個(gè)因素對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響的主次為D>C>B>A>E，即裝液量的影響最大，接種量和發(fā)酵溫度的影響次之，發(fā)酵時(shí)間和起始pH值的影響較小。由表3可知，因素C和D在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著影響，而因素A、B和E沒(méi)有顯著影響。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果可知，發(fā)酵條件的最佳組合為A2B2C2D3E2，即控制搖床轉(zhuǎn)速為 200 r/min 時(shí)，最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度 30 ℃、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL以及發(fā)酵起始pH值為76，此條件下藍(lán)色素的產(chǎn)量最高。

2.7驗(yàn)證試驗(yàn)

由正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果得知最優(yōu)發(fā)酵條件的組合不在16個(gè)試驗(yàn)內(nèi)，該發(fā)酵條件是否是真正最優(yōu)，還需做實(shí)際驗(yàn)證試驗(yàn)。按最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，正交優(yōu)化后藍(lán)色素最低產(chǎn)量為74.4 U/mL，藍(lán)色素最高產(chǎn)量為75.1 U/mL；藍(lán)色素的平均產(chǎn)量為 74.8 U/mL，與正交試驗(yàn)結(jié)果中的最高產(chǎn)量73.1 U/mL在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異，由此可知正交優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果可以作為鏈霉菌D2013產(chǎn)藍(lán)色素的最佳發(fā)酵條件，與優(yōu)化前（56.1 U/mL）比較，藍(lán)色素的產(chǎn)量提高了33.3%。

3結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量、發(fā)酵起始pH值對(duì)鏈霉菌D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)優(yōu)化了鏈霉菌D2013的發(fā)酵條件。鏈霉菌D2013在固定的搖床轉(zhuǎn)速（200 r/min）下最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度 30 ℃、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL、發(fā)酵起始pH值7.6，藍(lán)色素的平均產(chǎn)量達(dá)到74.8 U/mL。

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