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        希金斯炭疽菌磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C生物信息學(xué)分析

        2017-02-05 19:05:21韓長(zhǎng)志
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
        關(guān)鍵詞:分析

        doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.046

        摘要:希金斯炭疽菌侵染菜心、蘿卜等十字花科植物引起炭疽病,給各國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?;卺劸平湍傅湫偷牧姿峒〈继禺愋粤字窩(PI-PLC)序列,利用Blastp以及關(guān)鍵詞對(duì)該菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)、搜索,以及通過SMART分析,明確該菌存在8個(gè)典型的PI-PLC序列;通過生物信息學(xué)分析,明確上述PI-PLC序列在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成、信號(hào)肽等方面均具有一定差異。遺傳關(guān)系比較分析明確該菌中的PI-PLC序列與禾谷炭疽菌(Colletorichum graminicola)、松針炭疽菌(C. fioriniae)等炭疽菌屬中的病菌具有較近的親緣關(guān)系。

        關(guān)鍵詞:希金斯炭疽菌;磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C;亞細(xì)胞定位;二級(jí)結(jié)構(gòu);炭疽菌屬

        中圖分類號(hào):S432.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0177-04

        收稿日期:2015-08-28

        基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31560211);云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(編號(hào):ZK150004);云南省優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào):50097505);云南省高校林下生物資源保護(hù)及科用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào):2014015);云南省教育廳科學(xué)研究基金(編號(hào):2014Y330)。

        作者簡(jiǎn)介:韓長(zhǎng)志(1981—),男,河北石家莊人,博士,講師,主要從事經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)研究。Tel:(0871)63862918;E-mail:hanchangzhi2010@163.com。植物與病原菌互作過程中,眾多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與其中,現(xiàn)已明確G蛋白信號(hào)途徑及其下游的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑和cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有重要的作用。因此,學(xué)術(shù)界關(guān)于真菌RGS的研究產(chǎn)生了較多成果[1],磷酸肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的一種異構(gòu)體PI-PLC β為磷脂肌醇信號(hào)途徑PKC系統(tǒng)中的重要效應(yīng)物[2],可以將4,5-二磷酸磷脂酰肌醇水解為三磷酸肌醇和二酰甘油,而上述分子均作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使,發(fā)揮著重要作用。

        希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc.)可以侵染菜心、蘿卜等十字花科蔬菜引起炭疽病,該菌現(xiàn)主要分布于美國(guó)、日本、印度等國(guó)家[3-5],在我國(guó),由該菌侵染菜心引起的炭疽病成為影響菜心產(chǎn)量和品質(zhì)的重要危害之一[6]。國(guó)內(nèi)外對(duì)該菌的研究主要集中在病菌的生物學(xué)特性[7]、生防菌篩選[8]、遺傳轉(zhuǎn)化[9-10]以及不同營(yíng)養(yǎng)元素(硅、氮、鉀等)[11-14]、外源酚酸類物質(zhì)pHBA[15]控制病害等方面,同時(shí),隨著該基因組序列的釋放[16],林春花等對(duì)其開展了MAPK途徑相關(guān)基因的找尋及信號(hào)通路簡(jiǎn)圖的繪制工作[17],韓長(zhǎng)志對(duì)其進(jìn)行了RGS[18]、14-3-3[19]、septin[20]、AC、PITP等蛋白生物信息學(xué)分析。此外,對(duì)于該菌致病基因的研究,建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)及直接重復(fù)重組介導(dǎo)的基因打靶等技術(shù)[9-10]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)黃俊斌教授實(shí)驗(yàn)室建立了希金斯炭疽菌轉(zhuǎn)化子的突變體庫,為進(jìn)一步對(duì)這些轉(zhuǎn)化子基因功能研究提供了技術(shù)支持[21-22]。然而,對(duì)于該菌中存在的PI-PLC數(shù)量、功能尚不清楚。本研究利用釀酒酵母S288c(Saccharomyces cerevisiae S288c)中已經(jīng)報(bào)道的PI-PLC氨基酸序列,通過在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp比對(duì)分析[23],以及通過關(guān)鍵詞搜索,獲得與釀酒酵母PI-PLC同源的希金斯炭疽菌序列,并通過保守結(jié)構(gòu)域分析、疏水性分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)位等生物信息學(xué)分析以及遺傳關(guān)系分析,以期為進(jìn)一步開展希金斯炭疽病菌的研究提供重要的指導(dǎo)。

        1材料與方法

        1.1材料

        根據(jù)釀酒酵母S288c中含有的1個(gè)PI-PLC氨基酸序列,利用炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫在線Blastp比對(duì),同時(shí)通過輸入“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“Phospholipase C”“PLC”關(guān)鍵詞在上述數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索PLC(表1)。

        1.2方法

        1.2.1保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)利用SMART網(wǎng)站[24]在線分析 PI-PLC所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征。

        1.2.2蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)利用Protscale程序[25]對(duì)PI-PLC進(jìn)行疏水性測(cè)定。

        1.2.3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽預(yù)測(cè)對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測(cè)利用TargetP 1.1 Server在線分析實(shí)現(xiàn)[26],信號(hào)肽的預(yù)測(cè)則是利用SignalP 3.0 Server[27]在線分析實(shí)現(xiàn)。

        1.2.4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用PHD[28]在線分析實(shí)現(xiàn),利用TMHMM Server v. 2.0[27]實(shí)現(xiàn)PI-PLC的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

        1.2.5亞細(xì)胞定位分析利用ProtComp v 9.0實(shí)現(xiàn)PI-PLC的亞細(xì)胞定位分析[29]。

        1.2.6系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建在NCBI中,以希金斯炭疽菌中所含PI-PLC氨基酸序列為基礎(chǔ),在線進(jìn)行Blastp同源搜索,獲得來自不同物種的同源蛋白質(zhì)序列。對(duì)所獲得的同源序列,利用ClustalX[30]進(jìn)行多重比對(duì)分析,隨后利用 MEGA 5.2.2 軟件[31]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

        2結(jié)果與分析

        2.1希金斯炭疽菌中8個(gè)PI-PLC均具有典型的PLCXc或者PLCYc保守結(jié)構(gòu)域

        通過Blastp比對(duì)分析,共獲得10個(gè)同源序列,同時(shí),利用3個(gè)關(guān)鍵詞搜索,分別獲得8、9、7個(gè)蛋白序列,對(duì)上述蛋白進(jìn)行整理、去除重復(fù),共獲得9個(gè)蛋白,其ID分別為CH063_08309.1、CH063_07411.1、CH063_07011.1、CH063_05432.1、CH063_04045.1、CH063_03075.1、CH063_02624.1、CH063_00149.1、CH063_00100.1(表1)。其中,發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白序列(CH063_04045.1)僅可以通過Phospholipase-C搜索到,不能通過“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“PLC”搜索到,該蛋白通過Blastp也未能比對(duì)到,有待于進(jìn)一步核實(shí);隨后,利用SMART在線分析,結(jié)果顯示,僅有8條序列具有典型的PLCXc保守域結(jié)構(gòu),同時(shí)還具有諸如PLCYc、C2等保守結(jié)構(gòu)域(圖1)。

        對(duì)CH063_04045.1進(jìn)行深入分析,明確該蛋白為肌醇鞘磷脂磷脂酶C,并不是G蛋白下游的效應(yīng)因子,同時(shí),基于SMART分析,該蛋白并不含有磷脂酶所含有的保守PLCXc或者PLCYc結(jié)構(gòu)域,因此將該蛋白排除。根據(jù)上述分析,共獲得8條蛋白序列,依據(jù)其氨基酸大小進(jìn)行排序,分別將其命名為ChPLC1、ChPLC2、ChPLC3、ChPLC4、ChPLC5、ChPLC6、ChPLC7、ChPLC8(表1)。

        2.2ChPLC2具有典型的信號(hào)肽區(qū)域

        通過SignalP分析,除ChPLC2在N端含有1個(gè)典型信號(hào)肽序列外,其他PI-PLC均不含有信號(hào)肽;同時(shí),通過TMHMM分析,除ChPLC2在N端含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域外,其他PI-PLC均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1),鑒于TMHMM不能將蛋白中所含的信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域嚴(yán)格區(qū)分,因此,ChPLC2在N端含有的序列結(jié)構(gòu)是信號(hào)肽,而不是由TMHMM、SMART程序所預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1)。

        2.3希金斯炭疽菌PI-PLC均為親水性蛋白

        通過疏水性分析,明確ChPLC1和ChPLC2、ChPLC3和ChPLC6、ChPLC4和ChPLC5在疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基上相同,分別為L(zhǎng)、I、V;ChPLC1和ChPLC8、ChPLC4和ChPLC6在親水性最強(qiáng)氨基酸殘基上相同,分別為R、E(表2)。盡管如此,其他PI-PLC彼此之間在親(疏)水性最強(qiáng)氨基酸殘基及位置方面仍然存在較大的差異(表2、圖2),推測(cè)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,PI-PLC所具有的功能存在一定的差異性。

        2.4二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

        明確8個(gè)PI-PLC均含有無規(guī)卷曲、α-螺旋以及β-轉(zhuǎn)角,所占比例不盡相同。就所含的無規(guī)卷曲比例而言,ChPLC2最低,為17%,ChPLC8最高,為45%,其他PI-PLC所含比例集中于20%~35%;就所含的α-螺旋而言,ChPLC1最低,為5%,ChPLC7最高,為41%,其他PI-PLC所含比例集中于20%~40%;就β-轉(zhuǎn)角而言,ChPLC3最低,為5%,ChPLC1最高,為44%,其他PI-PLC所含比例集中于5%~25%(圖3)。

        2.5轉(zhuǎn)運(yùn)肽及亞細(xì)胞定位分析

        轉(zhuǎn)運(yùn)肽分析結(jié)果顯示,除ChPLC2明確定位于分泌途徑,ChPLC1、ChPLC4、ChPLC7定位于線粒體,其他PI-PLC定位在任何位置(表3)。為了更好地明確PI-PLC的亞細(xì)胞定位,利用ProtComp進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,ChPLC1、ChPLC7定位于線粒體,這與通過TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果相同,ChPLC2定位于細(xì)胞膜,ChPLC3、ChPLC6定位于細(xì)胞核,ChPLC4、ChPLC5、ChPLC7定位于細(xì)胞質(zhì)中(數(shù)據(jù)未顯示)。上述定位預(yù)測(cè)結(jié)果說明希金斯炭疽菌中數(shù)量眾多的PI-PLC定位情況不盡相同,在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著不同的功能。

        2.6遺傳關(guān)系分析

        通過在NCBI中對(duì)PI-PLC進(jìn)行Blastp比對(duì),獲得與希金斯炭疽菌PI-PLC的同源序列,選擇炭疽菌屬真菌其他序列進(jìn)行遺傳關(guān)系分析。結(jié)果顯示,就物種之間關(guān)系而言,該菌中的PI-PLC與禾谷炭疽菌、松針炭疽菌親緣關(guān)系較近;就該菌中的PI-PLC之間的關(guān)系而言,8個(gè)PI-PLC可以大致聚為五大類,具體而言,ChPLC6、ChPLC5、ChPLC7關(guān)系較近,為一類;ChPLC3與ChPLC1關(guān)系較近,為一類;ChPLC8、ChPLC4、ChPLC6各為一類。

        3結(jié)論與討論

        隨著希金斯炭疽菌全基因組序列的釋放[16],為深入解析該菌致病因子研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐,一些涉及G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的重要效應(yīng)物[18,32]以及MAPK途徑上的重要蛋白得到進(jìn)一步明確[17]。本研究基于前人研究成果,明確了該菌中存在7個(gè)典型的PI-PLC,初步明確了上述蛋白具有典型的PLCXc、PLCYc、C2等保守結(jié)構(gòu)域、均為親水性蛋白等特點(diǎn)。盡管如此,希金斯炭疽菌中8個(gè)PI-PLC彼此之間在亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)組成方面存在一定差異,推測(cè)上述蛋白在不同位置發(fā)揮不同作用,同時(shí),對(duì)上述PI-PLC與其他物種進(jìn)行遺傳關(guān)系分析,明確希金斯炭疽菌與松針炭疽菌親緣關(guān)系較近,為進(jìn)一步深入研究其他炭疽菌屬真菌PI-PLC打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過深入解析希金斯炭疽菌中G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的致病因子,有助于為開發(fā)用于以G蛋白信號(hào)通路為作用靶標(biāo)的化學(xué)藥劑提供重要的理論意義。

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