李敏++馬祥建++李玉娟++王瑩++談峰+++張健

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.025

摘要：將蘇云金芽孢桿菌Cry3A類(lèi)抗蟲(chóng)基因經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后與植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6連接，構(gòu)建pCAMBIA1304-C6-Cry3A重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，同時(shí)進(jìn)行雙酶切、測(cè)序及PCR鑒定。結(jié)果表明：雙酶切及測(cè)序產(chǎn)物與預(yù)期擴(kuò)增片段相符，重組表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A構(gòu)建成功；農(nóng)桿菌LBA4404中含有重組質(zhì)粒，成功構(gòu)建了Cry3A農(nóng)桿菌基因工程菌株。

關(guān)鍵詞：柳樹(shù)；抗蟲(chóng)基因；Cry3A；表達(dá)載體構(gòu)建

中圖分類(lèi)號(hào)： S722.3+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0108-02

收稿日期：2015-08-25

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（14）5094]；江蘇省南通市科技局科技創(chuàng)新計(jì)劃（編號(hào)：HL2013028）。

作者簡(jiǎn)介：李敏（1981—），女，江蘇如東人，碩士，副研究員，主要從事耐鹽林木育種與栽培研究。E-mail：alice04@163.com。

通信作者：張健，博士，副研究員。E-mail：yjnkyy@sohu.com。柳樹(shù)是我國(guó)沿海灘涂重要的綠化造林樹(shù)種之一，當(dāng)單品種大面積造林時(shí)，會(huì)造成柳樹(shù)害蟲(chóng)大面積發(fā)生。在江蘇南通地區(qū)對(duì)柳樹(shù)造成嚴(yán)重危害的是食葉害蟲(chóng)柳藍(lán)葉甲（Plagiodera versicolora），它屬鞘翅目葉甲科，成蟲(chóng)咬食柳樹(shù)葉片造成缺刻或孔洞；幼蟲(chóng)多聚集危害幼嫩葉片，高齡幼蟲(chóng)少有單獨(dú)為害成熟葉片，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)葉片幼蟲(chóng)可高達(dá)30多頭/張，危害嚴(yán)重時(shí)能食光柳樹(shù)初生的嫩芽及嫩葉，影響柳樹(shù)正常生長(zhǎng)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法存在很多弊端，如污染環(huán)境，能使害蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性[1]。在基因工程技術(shù)飛速發(fā)展的今天，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為柳樹(shù)害蟲(chóng)防治的關(guān)注焦點(diǎn)。

本研究針對(duì)柳樹(shù)嚴(yán)重的蟲(chóng)害現(xiàn)象，選用Cry3A類(lèi)抗鞘翅目害蟲(chóng)基因[2]，構(gòu)建抗蟲(chóng)植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A，重組表達(dá)載體經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌制備基因工程菌，為今后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)耐鹽柳樹(shù)育種和耐鹽柳樹(shù)抗蟲(chóng)效用研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌種大腸桿菌DH5α，根癌農(nóng)桿菌LBA4404、pCAMBIA1304-C6植物表達(dá)載體均由北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供，含有目的基因的質(zhì)粒pUC57-Cry3A由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成。

1.1.2酶和生化試劑限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ，T4 DNA連接酶、Taq DNA酶[購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司]。膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物回收試劑盒[購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司]。卡那霉素與LB培養(yǎng)基所用的胰蛋白胨（trypton）、酵母浸膏（yeast extract）、氯化鈉瓊脂等[購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2方法

1.2.1重組表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A的構(gòu)建pUC57-Cry3A質(zhì)粒和pCAMBIA1304-C6質(zhì)粒載體經(jīng)大量提取與純化后，分別用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，分別回收pUC57-Cry3A小片段和pCAMBIA1304-C6大片段，通過(guò)T4 DNA連接酶連接這2個(gè)片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB 固體平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落。用Cry3A基因特異的引物（正向5′-CACACAGCCAGGGTCGTATT-3′，反向5′-AGCACGGTAAGGGTCATCTC-3′）進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性菌株。在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，BamHⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化子[3]。經(jīng)鑒定的重組子命名為pCAMBIA1304-C6-Cry3A。并將相應(yīng)的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.2農(nóng)桿菌pCAMBIA1304-C6-Cry3A重組菌株的構(gòu)建用液氮凍融法將構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，在含有卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的YEB固體平板上培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取7個(gè)單菌落，分別接種于3 mL 含有卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 搖床過(guò)夜培養(yǎng)[4]。各取2 μL菌液為模板，用引物F1、R1進(jìn)行PCR鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1重組表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A的構(gòu)建

采用BamHⅠ和SalⅠ分別對(duì)質(zhì)粒pUC57-Cry3A和pCAMBIA1304-C6進(jìn)行雙酶切，切膠回收長(zhǎng)度為1 806 bp的Cry3A基因片段和長(zhǎng)度為15 140 bp的pCAMBIA1304-C6載體骨架。通過(guò)T4 DNA連接酶將目的片段連接到載體上，經(jīng)過(guò)大腸桿菌中的菌落PCR，質(zhì)粒酶切（圖1）和測(cè)序等過(guò)程，表明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒（圖2）。

2.2重組表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的驗(yàn)證

將pCAMBIA1304-C6-Cry3A重組質(zhì)粒，按“1.2.2”節(jié)方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。各菌液和陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1304-C6-Cry3A質(zhì)粒均能擴(kuò)增出目的基因片段，而陰性對(duì)照LBA4404菌液未能擴(kuò)增出目的片段（圖3）。表明pCAMBIA1304-C6-Cry3A質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，成功構(gòu)建農(nóng)桿菌基因工程菌株，可進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。

3結(jié)論與討論

1981年第1個(gè)編碼蘇云金桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白基因被Schnepf等成功克隆[5]，從此揭開(kāi)了利用基因工程培育抗蟲(chóng)植物的序幕。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Bt殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入各種Bt野生菌株構(gòu)建具有使殺蟲(chóng)機(jī)制多樣化[6]、擴(kuò)大殺蟲(chóng)譜[7]、降低害蟲(chóng)抗藥率[8]等優(yōu)勢(shì)的殺蟲(chóng)工程菌的方法已廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)生物防治領(lǐng)域[9-10]。武漢大學(xué)高梅影等就曾從中國(guó)土壤中分離出2株產(chǎn)近菱形的薄扁伴孢晶體的殺鞘翅目昆蟲(chóng)的蘇云金芽孢桿菌YM-03及SHQ11-10，生物毒力試驗(yàn)中其稀釋400倍的制劑噴霧對(duì)柳藍(lán)葉甲（Plagiodera versicolora）及馬鈴薯甲蟲(chóng)防治效果達(dá)94.6%[11]。到目前為止已報(bào)道的編碼cry蛋白的基因超過(guò)300個(gè)，其中cry3、cry5、 cry7、cry8和cry18A系列的蛋白基因?qū)η食崮坷ハx(chóng)具有專(zhuān)一毒性，并且當(dāng)中cry3Aa基因?qū)Ｒ恍院投拘宰罡?，從?xì)胞營(yíng)養(yǎng)期開(kāi)始即可不依賴(lài)芽孢的產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，且表達(dá)的蛋白多肽分子量較小，易于被昆蟲(chóng)中腸液降解為 55 ku 的毒性多肽，而且遺傳背景也最清楚，因此國(guó)內(nèi)外一般都優(yōu)先選用cry3Aa基因作為抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入微生物，構(gòu)建具有抗鞘翅目昆蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性的重組Bt殺蟲(chóng)劑[12-13]。

綜合考慮，筆者選擇了BtCry3A類(lèi)基因，成功構(gòu)建抗蟲(chóng)植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A，為下一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)柳樹(shù)育種研究奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)的試驗(yàn)中，將構(gòu)建雙價(jià)抗蟲(chóng)植物表達(dá)載體，對(duì)轉(zhuǎn)單價(jià)和雙價(jià)柳樹(shù)植株抗蟲(chóng)性方面進(jìn)行比較，以期為耐鹽柳樹(shù)害蟲(chóng)綠色防控提供方法及獲得具有高效廣譜抗蟲(chóng)性的轉(zhuǎn)Bt基因柳樹(shù)植株。

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