蘭英++柳敏++嚴(yán)鑄云++謝惠慶++沈曉鳳++張禮++林嬋春

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.024

摘要：建立不同地理種源丹參（四川、山東、河南）組織培養(yǎng)條件，比較其組培苗及大田栽種后植株間的生物學(xué)性狀差異。以不同地理種源盆栽丹參莖尖嫩葉為外植體，經(jīng)70%的乙醇處理10 s后，再用2%的NaClO溶液滅菌20 min效果較好，污染率僅為5%。葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代增殖最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，出愈率達(dá)到96.7%；芽分化的最佳激素條件為1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；幼苗生根的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，生根率為94%。結(jié)果顯示不同地理種源丹參組培苗及大田栽培后植株間根部特征、株高、葉形及開花與否均有較大差異。這為進(jìn)一步探索3個(gè)種源丹參根系分泌物的差異及其與品質(zhì)形成的關(guān)系提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：丹參；組培快繁；植株再生；生物學(xué)性狀

中圖分類號(hào)： S567.5+30.43文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0103-05

收稿日期：2015-08-13

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81173493）。

作者簡(jiǎn)介：蘭英，女，重慶人，碩士研究生，主要從事中藥資源與開發(fā)利用研究。E-mail：961269730@qq.com。

通信作者：嚴(yán)鑄云，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事道地藥材品質(zhì)形成與調(diào)控研究。E-mail：cdtcmyan@126.com。丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，具有活血化瘀、消腫止痛、養(yǎng)血安神的功能，是常用的重要中藥[1]；廣泛分布于四川、河南、山東、安徽、陜西等省區(qū)，具有較強(qiáng)的土壤適應(yīng)性[2]。前期研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地丹參栽培中普遍存在連作障礙及病毒積累等問題，而其有效成分含量差異明顯，這與其遺傳特性有關(guān)[3-4]。本試驗(yàn)以3個(gè)不同地理種源的丹參植株為材料，利用組織培養(yǎng)具備繁殖速度快、脫除病毒且保證植株遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，建立山東臨朐、河南方城、四川中江3個(gè)種源丹參的組培快繁體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)3種不同丹參組培苗的快速繁殖，并將試管苗移栽于四川中江進(jìn)行大田培育，比較其生物學(xué)性狀的差異，為后期探索不同丹參遺傳特性與其藥材品質(zhì)形成的關(guān)系提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

丹參種源于2012年12月分別采自四川省中江縣石泉鄉(xiāng)、山東省臨朐縣呂匣鎮(zhèn)、河南省方城縣拐河鎮(zhèn)3個(gè)不同產(chǎn)區(qū)，根段繁殖，翌年開花后，經(jīng)鑒定均為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）。

1.2儀器與試劑

儀器：SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司），JA5003電子天平（上海良平儀器儀表有限公司），MLS-3020自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本三洋公司），PHS-3C+ 酸度計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司），MLR-350HT組培箱（日本三洋公司）。

試劑：MS培養(yǎng)基（杭州臨安木木生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20120701），6-BA（濟(jì)南昊天科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20110603），NAA（濟(jì)南昊天科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20110607），2，4-D（濟(jì)南昊天科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20101107），維生素B1（成都市科龍化工試劑廠 批號(hào)20111023），蔗糖（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20090610），瓊脂粉（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20111001），蒸餾水。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1無菌外植體的獲得取樣前將丹參植株移至室內(nèi)培養(yǎng)1周后，采取植株莖尖1～2片新葉，用無菌紗布包裹置于自來水下沖洗1 h。將沖好的嫩葉用無菌水洗滌5次后置于超凈工作臺(tái)中，先后用70%的乙醇和2%的NaClO溶液進(jìn)行不同時(shí)間的滅菌處理，期間不斷攪拌使葉片與消毒液充分接觸[5-6]。最后用無菌水沖洗4次后切塊接種于培養(yǎng)基上。1周后統(tǒng)計(jì)其滅菌后的生長(zhǎng)狀況及污染率，篩選出最佳的滅菌時(shí)間組合。污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%[7]。

1.3.2丹參愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)將滅菌好的嫩葉剪成約0.5 cm×0.5 cm的小塊，并用解剖刀輕輕將其表面劃傷，背接（背面向上）于附加不同濃度生長(zhǎng)素（NAA、2，4-D）和細(xì)胞分裂素（6-BA）配比的MS培養(yǎng)基上（含蔗糖3%、瓊脂0.7%，pH 5.8～6.0，121 ℃、1.1 kg/cm2條件下滅菌 15 min）。每種處理培養(yǎng)10瓶，每瓶接種3塊，培養(yǎng)5 d后將無菌的組織塊接入新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。于（25±2） ℃下黑暗培養(yǎng)，每隔5 d對(duì)其生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察，20 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)并計(jì)算誘導(dǎo)率，同時(shí)記錄愈傷組織的顏色、質(zhì)地和生長(zhǎng)情況。愈傷組織誘導(dǎo)率按出愈率計(jì)算，公式如下[7]：

出愈率=[無污染愈傷組織數(shù)/（總接種數(shù)-污染數(shù)）]×100%。

將上述已分化愈傷組織分割成大小約0.5 cm×0.5 cm的小塊后，轉(zhuǎn)移到與誘導(dǎo)愈傷相同激素比例的增殖培養(yǎng)基中，于（25±2） ℃黑暗條件下繼代培養(yǎng)。

1.3.3叢生芽的誘導(dǎo)將愈傷組織分割成大小約0.5 cm×0.5 cm 的小塊后，轉(zhuǎn)移到附加不同濃度生長(zhǎng)素（NAA）和細(xì)胞分裂素（6-BA）的MS增殖培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基組成同“1.2.2”節(jié)）。溫度（25±2） ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時(shí)間 11 h/d 條件下培養(yǎng)，20 d后記錄叢生芽生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3.4根的發(fā)生取增殖培養(yǎng)中生長(zhǎng)的丹參無根苗莖尖端2～3 cm，同時(shí)將未分化成苗的芽叢分割成單芽，接種到附加不同濃度的NAA 和IBA的1/2MS生根培養(yǎng)基中（含蔗糖 1.5%、瓊脂0.8%，pH 5.8～6.0，121 ℃、1.1 kg/cm2條件下滅菌15 min）。以不添加任何激素的1/2MS為對(duì)照培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件同上述處理。統(tǒng)計(jì)各種激素條件下2種材料的最早生根時(shí)間，并在培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)其生根率并記錄生長(zhǎng)狀況。生根率計(jì)算公式如下：

生根率=[形成根的苗數(shù)/（接種數(shù)-污染數(shù)）]×100%。

將采自同一植株的河南方城和四川中江丹參外植體按最佳滅菌條件滅菌后，接種于山東臨朐丹參組培中各階段優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基上，于同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以期獲得3個(gè)不同地理種源的丹參無菌組培苗，比較其性狀的差異。至根長(zhǎng)至5～8 cm時(shí)取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基后，移栽于含滅菌基質(zhì)（腐殖土 ∶珍珠巖比例為3 ∶1）的育苗杯中室內(nèi)光照煉苗。成活后移栽到四川省中江縣石泉鄉(xiāng)進(jìn)行大田栽培，不同種源丹參以相同方式管理。于栽種1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)其幼苗存活率，并分別補(bǔ)苗以保證各種源丹參幼苗35株以上。定期觀察不同地理種源丹參大田栽培的植株生物學(xué)性狀差異。

2結(jié)果與分析

2.1丹參外植體的最佳滅菌條件

取同一丹參植株切根繁殖的丹參苗莖尖嫩葉為組培外植體，按“1.3.1”節(jié)的步驟進(jìn)行不同滅菌時(shí)間的處理后接種于不含激素的MS培養(yǎng)基上（同“1.3.2”節(jié)）。其滅菌情況及丹參葉片生長(zhǎng)狀態(tài)見表1。

盆栽丹參莖尖嫩葉因暴露于空氣中易被微生物污染，在置入培養(yǎng)基之前必須經(jīng)過表面滅菌，但不同滅菌劑、滅菌濃度及滅菌時(shí)間的滅菌效果不一樣，且表面滅菌劑對(duì)植物組織會(huì)有一定的傷害作用。文獻(xiàn)報(bào)道多以氯化汞作為滅菌劑[8-9]，考慮到氯化汞雖具有較好的滅菌效果，但毒性較大，易損傷外植體，且滅菌后難以除去，因此本試驗(yàn)中以70%的乙醇溶液和2% NaClO組合滅菌。從表1可以看出，先用70%的乙醇處理10 s后再用2%的NaClO溶液滅菌20 min效果最好，污染率僅為5%。其他滅菌時(shí)間均不理想。

2.2外源激素對(duì)愈傷組織形成的誘導(dǎo)

將滅菌好的組織塊分別接種到6-BA、NAA、2，4-D不同濃度組合的培養(yǎng)基上，25 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見表2。

從表2可見，不同外源激素和相同外源激素的不同比例處理時(shí)，外植體的生長(zhǎng)情況有較大差異，當(dāng)用6-BA單因素處理時(shí)，隨著濃度的增加，外植體增長(zhǎng)較快且芽的分化率較高，同時(shí)有的葉片在接觸培養(yǎng)基的部位可不經(jīng)過明顯的愈傷組織階段而直接分化出芽，表明細(xì)胞分裂素可明顯促進(jìn)芽的分化及生長(zhǎng)。將6-BA與NAA配合使用，在適宜濃度下培養(yǎng)7 d左右，可見葉片皺縮增大，中部隆起，葉緣及切口處開始膨大，葉片顏色變淺，外植體進(jìn)入脫分化階段（圖1-A）。至15 d時(shí)，整個(gè)葉片呈黃白色，切口處形成無固定形態(tài)的細(xì)胞團(tuán)，并有少量不定芽形成（圖1-B）。30 d時(shí)葉片基本完全脫分化形成愈傷組織，具少數(shù)叢生芽（圖1-C）。最佳的激素組合是2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，出愈率達(dá)到967%。生長(zhǎng)素濃度過低時(shí)葉片脫分化較緩慢， 可見生長(zhǎng)素在葉片脫分化過程中起著至關(guān)重要的作用。這可能與生長(zhǎng)素可啟動(dòng)細(xì)胞中DNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯，活化細(xì)胞代謝，啟動(dòng)細(xì)胞分裂有關(guān)。6-BA與2，4-D搭配使用，外植體未明顯長(zhǎng)大且形成少量愈傷組織，培養(yǎng)過程中逐漸褐化、死亡。這可能是因?yàn)?，4-D誘導(dǎo)愈傷組織中的多酚氧化酶活性升高，或是對(duì)外植體的毒害作用導(dǎo)致其褐化[10]。

2.3外源激素對(duì)芽分化的誘導(dǎo)

愈傷組織分割成約0.5×0.5 cm2的小塊后，轉(zhuǎn)移到 6-BA、NAA和2，4-D不同組合的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，20 d后觀察組織塊的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果見表3。

從表3可見，6-BA與NAA組合應(yīng)用時(shí)，可促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，且當(dāng)6-BA與NAA濃度比值較大時(shí)可明顯地誘導(dǎo)愈傷組織分化產(chǎn)生叢生芽，甚至長(zhǎng)成無根幼苗，這與Skoog提出的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比例較高時(shí)利于芽生長(zhǎng)，而比值較低時(shí)有利于根的分化相一致。但1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA與2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高濃度誘導(dǎo)的叢生芽分化較快，玻璃化嚴(yán)重而變脆，芽叢葉片大而密集，生根培養(yǎng)難以成活。且激素用量較大會(huì)增大植株的變異概率，不利于保持試管苗的遺傳穩(wěn)定性[11]。而低濃度組合誘導(dǎo)叢生芽生長(zhǎng)正常，且有少數(shù)無根苗（圖1-D）。相同比例的6-BA和2，4-D搭配后加入到增殖培養(yǎng)基中，未見芽的分化，愈傷組織增大不明顯，但愈傷組織呈疏松的黃白色?？梢姡?，4-D并不能誘導(dǎo)愈傷組織分化出芽叢，甚至抑制了6-BA的誘導(dǎo)效果，但明顯地改善了其生長(zhǎng)狀態(tài)，這有利于在懸浮培養(yǎng)時(shí)得到均一分散的細(xì)胞懸浮液。因此在叢生芽的誘導(dǎo)時(shí)，以1.0 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA配合使用效果更佳，這與李明軍等報(bào)道的裕丹參愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素比相同[12]。而當(dāng)需要將培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，可考慮將生長(zhǎng)良好的愈傷組織塊接種于含1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，待愈傷組織呈疏松易分散狀態(tài)時(shí)再進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，可獲得較好的效果。

2.4外源激素對(duì)根發(fā)生的影響

將2～3 cm的無根苗莖尖及幼芽分別接種于NAA與IBA不同組合的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，總共設(shè)計(jì)5組激素組合，觀察不同激素條件下最早的生根時(shí)間、生根率及根和幼苗的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見表4。

將芽和無根苗接種到同樣的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根時(shí)，大多幼芽均基部褐化死亡，而無根幼苗的莖尖多數(shù)能產(chǎn)生根，說明丹參無根苗比幼芽更容易生根。這可能是由于幼芽分化程度相對(duì)較低，其內(nèi)源激素水平及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)力較差，使其不能正常分化產(chǎn)生根，而丹參苗具有完整的頂芽、葉片，有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能合成自身所需的生長(zhǎng)素，從而促進(jìn)莖的基部生根。因此，在生根培養(yǎng)時(shí)以無根苗的莖尖扦插可提高成活率。當(dāng)以NAA和IBA配合使用誘導(dǎo)生根時(shí)，比值較高時(shí)則會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生不正常幼根，表面微褐化，極易脫落，最早生根時(shí)間較長(zhǎng)，且移栽成活率低；比值較低時(shí)則可誘導(dǎo)產(chǎn)生較多幼根，其中最佳組合為0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，最早生根，且生根率達(dá) 94%（圖1-E）。而當(dāng)單獨(dú)使用 0.5 mg/L IBA時(shí)，雖誘導(dǎo)生根較快，但苗瘦高，移栽時(shí)易受損傷而難以成活。試驗(yàn)中未添加激素的空白組也能誘導(dǎo)無根苗生根，但較為緩慢， 生根率較低，這可能是其內(nèi)源激素促進(jìn)其自發(fā)生根，與蔡朝暉等的試驗(yàn)現(xiàn)象相同[13]。

2.5不同種源丹參組培苗的性狀比較

3個(gè)不同種源的丹參外植體均能適應(yīng)優(yōu)選的最佳組培條件，實(shí)現(xiàn)丹參無菌組培苗的快速繁殖，但不同種源丹參組培苗性狀及移栽成活率有所不同（表5）。于四川省中江縣石泉鄉(xiāng)大田栽培后，不同種源丹參植株生物學(xué)性狀差異較大（表6、圖2、圖3）。

雖然3個(gè)不同種源丹參的遺傳特性有所不同，但試驗(yàn)中篩選的最佳組培條件成功應(yīng)用于3種丹參的組培快繁，說明所獲得的最佳激素比例具較廣適用性，可用于丹參無菌組培苗的大量繁育。但經(jīng)四川中江大田栽培存活率均較低，可能與丹參組培苗過于幼小及一直處于室內(nèi)環(huán)境煉苗有關(guān)，建議后期大田移栽前進(jìn)行室外煉苗以增強(qiáng)組培苗的適應(yīng)能力。河南方城丹參組培苗存活率最高（64.7%），其次是四川中江組培苗（42.2%），山東臨朐組培苗最低（37.5%）。這與不同種源丹參組培苗的性狀也有關(guān)，四川中江丹參組培苗雖較瘦高，但根多，且其外植體本身來源于當(dāng)?shù)卦耘嗟牡⒅仓辏虼艘圃院笕跃咻^強(qiáng)的適應(yīng)性，苗成活率較高；河南方城丹參組培苗根多且較粗，莖較粗壯，適應(yīng)性強(qiáng)，成活率高；而山東臨朐丹參組培苗根少，成活率最低。開花期，發(fā)現(xiàn)山東與河南丹參第一年均不開花，這與當(dāng)?shù)氐⒃耘嗲闆r相同，而于藥植園進(jìn)行多年栽培發(fā)現(xiàn)，山東、河南丹參第二年均開花，可能與其“生理記憶”相關(guān)。收獲期，山東臨朐丹參根結(jié)線蟲病極嚴(yán)重，呈紅色，而河南臨朐和四川中江丹參均無根結(jié)線蟲病發(fā)生，但根呈淺紅色，部分呈紅白相間。其根顏色的變化和發(fā)病情況是否與藥材有效成分含量及植株本身的抗病性有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

3討論

植物組織培養(yǎng)中影響因素很多，有物種的遺傳特性及生理狀態(tài)，植株的基因型及所處的發(fā)育階段等內(nèi)在因素，也包括激素、碳源、氮源、誘導(dǎo)因子等化學(xué)因素及光照、濕度、溫度等物理因素，還有共生菌等生物因素，均會(huì)影響植物組織培養(yǎng)的難易程度[14-17]。無菌外植體的獲得是建立無菌體系的關(guān)鍵，外源激素是誘導(dǎo)外植體分化的重要因素[11]。因此，本試驗(yàn)著重對(duì)其滅菌條件及組培各階段的最佳激素組合進(jìn)行優(yōu)化，并以不同地理種源的同一丹參植株為材料，以避免不同植株間的遺傳變異，同時(shí)獲得適應(yīng)3個(gè)不同種源丹參組培快繁的最佳培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)丹參組培苗的快速繁殖。

不同丹參的差異性比較多見于不同種質(zhì)間[18]，或者與人工誘導(dǎo)多倍體植株間的對(duì)比[19]，而不同地理種源丹參組培苗大田栽培過程中的生物學(xué)性狀差異未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的野生丹參，其生物學(xué)性狀并不完全一致，如遼寧丹參復(fù)葉為3出，少數(shù)5出，花冠深藍(lán)紫色，冠幅平均34.6 cm；陜西商洛丹參復(fù)葉變化較大，為3～7出，花冠藍(lán)紫色，冠幅478 cm[18]。同一野生丹參與其組培再生苗相比，其株高、冠幅、葉片等均有較大差異，有些變異甚至超出生態(tài)型的變異范圍[20]?？梢?，產(chǎn)地不同、生長(zhǎng)環(huán)境不同均會(huì)造成物種部分生物學(xué)性狀變異。本研究同樣發(fā)現(xiàn)不同地理種源丹參組培苗間及大田栽培植株間均有一定差異，這些差異是否穩(wěn)定傳遞，并與其丹參藥材的產(chǎn)量及有效成分的積累有關(guān)，還需進(jìn)一步觀察研究。

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