張仕林++許玉超++帥強(qiáng)++鄧鵬+++王建軍

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.022

摘要：探討洋蔥不同組織總RNA提取的最優(yōu)方法，以期為今后開(kāi)展洋蔥的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。以洋蔥品種W470發(fā)育旺盛時(shí)期的葉片、根、鱗莖為材料，比較TaKaRa試劑盒法、TIANGEN試劑盒法、TRIzol法、pBIOZOL法等4種RNA提取方法提取洋蔥RNA的效果。凝膠電泳結(jié)果顯示，除了TIANGEN試劑盒法不能提取洋蔥根的總RNA，其他方法在洋蔥不同組織中均可提取到不同質(zhì)量的RNA。對(duì)不同方法提取洋蔥RNA濃度、純度進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TaKaRa試劑盒法提取洋蔥葉片的總RNA濃度為342.31 μg/g，pBiozol法提取洋蔥鱗莖、根的總RNA濃度分別為 1 119.39、171.85 μg/mL。經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，TaKaRa試劑盒法提取的洋蔥葉片總RNA、pBIozol法提取洋蔥鱗莖、根的總RNA均成功擴(kuò)出洋蔥β-actin基因片段。由結(jié)果可知，TaKaRa試劑盒適合提取洋蔥葉片的總RNA，pBIOZOL法適合提取洋蔥鱗莖、根的總RNA且質(zhì)量能夠滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。

關(guān)鍵詞：洋蔥；總RNA；RNA提?。籖T-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S633.201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0095-03

收稿日期：2015-09-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：200903018）。

作者簡(jiǎn)介：張仕林（1989—），男，四川廣元人，碩士研究生，研究方向?yàn)檠笫[遺傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：709744424@qq.com。

通信作者：王建軍，碩士，副教授，主要從事洋蔥遺傳育種研究。E-mail：wangjianjun@njau.edu.cn。洋蔥（Allium cepa L.）為百合科蔥屬2年生蔬菜，在我國(guó)已廣泛栽培，并作為主要的出口蔬菜品種之一[1]。洋蔥不僅可以作為蔬菜和調(diào)味品，而且因其糖類(lèi)、硫化物含量豐富，從而具有降“三高”、降低和預(yù)防血栓形成風(fēng)險(xiǎn)以及預(yù)防心肌梗塞等功效。此外，洋蔥還含有特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)槲皮素，能抑制癌細(xì)胞活性、阻止癌細(xì)胞生長(zhǎng)、預(yù)防癌癥[2]。

RNA是一種重要的遺傳信息分子，提取高質(zhì)量RNA是進(jìn)行定量PCR、RT-PCR、 Northern雜交和cDNA文庫(kù)構(gòu)建等相關(guān)研究的前提條件[3-5]。目前有許多提取植物RNA的方法，例如CTAB法、SDS法、Trizol法等，但針對(duì)洋蔥不同組織的RNA提取研究卻鮮有報(bào)道。黃鈺等對(duì)分蘗洋蔥葉片RNA提取方法進(jìn)行比較和分析[3，6]。由于洋蔥各種組織，尤其是葉片、鱗莖中含有豐富的多糖等次生代謝物，而且多糖會(huì)抑制酶的活性[7]，導(dǎo)致洋蔥高質(zhì)量RNA的提取受到制約。此外，由于洋蔥不同組織內(nèi)含物成分不盡相同，在具體操作過(guò)程中對(duì)RNA提取方法的要求也不一樣。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)TaKaRa試劑盒法、TIANGEN試劑盒法、Trizol法以及pBIOZOL法等4種RNA提取方法的比較研究，建立1套適于洋蔥根、鱗莖、葉片材料的RNA提取方法，對(duì)于下一步開(kāi)展洋蔥相關(guān)功能基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究具有一定意義，同時(shí)也為從蔥屬植物中提取高質(zhì)量的RNA提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

于2015年3月25日選取洋蔥品種W470新鮮幼嫩的根、鱗莖、葉片，用蒸餾水沖洗干凈后，用液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室保存在-70 ℃冰箱，備用。試驗(yàn)材料由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)洋蔥課題組提供，樣本取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦園藝站。

主要試劑：TaKaRa試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；TIANGEN試劑盒，Tiangen Biotech公司；TRIzol試劑盒，Invitrogen公司；pBIOZOL試劑盒，Solarbio公司。試驗(yàn)所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其他生化試劑均為進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2RNA提取方法

試驗(yàn)所需塑料制品如Eppendorf管、吸頭、PCR管等均于37 ℃用0.1%DEPC水處理24 h后，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，80 ℃烘干后備用。玻璃器皿、研缽于200 ℃干熱滅菌2 h。每種洋蔥組織均使用以下4種方法提取總RNA，并做3次重復(fù)。

1.2.1TaKaRa試劑盒法稱(chēng)取50 mg洋蔥組織，參照 TaKaRa 試劑盒使用手冊(cè)中提取富含多糖類(lèi)組織的方法提取RNA。

1.2.2TIANGEN試劑盒法稱(chēng)取100 mg洋蔥組織，參照TIANGEN試劑盒使用手冊(cè)中提取富含多糖類(lèi)組織的方法提取RNA。

1.2.3TRIzol法稱(chēng)取各洋蔥組織100 mg，經(jīng)液氮研磨后，參照試劑盒說(shuō)明的方法提取并增加2次三氯甲烷-異戊醇（體積比24 ∶1）抽提，以去除蛋白質(zhì)、多糖、多酚等大分子物質(zhì)；用異丙醇沉淀RNA，于-20 ℃沉淀60 min。

1.2.4pBIOZOL法具體方法如下：稱(chēng)取100 mg洋蔥組織，液氮下迅速將其研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加1.3 mL裂解液，短暫漩渦混勻，至樣品完全重懸，室溫放置5 min（可將離心管水平放置，以增大裂解液與細(xì)胞接觸的表面積，有助于細(xì)胞破壁）。室溫下于12 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層液體至新的1.5 mL離心管中，加入100 μL 5 mol/L NaCl，混勻后加入300 μL三氯甲烷，劇烈振蕩以充分混勻，4 ℃、12 000 g離心10 min，上層液全部轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，用水飽和酚-三氯甲烷（體積比5 ∶1）、三氯甲烷-異戊醇（體積比24 ∶1）分別抽提1次，直至中間層較干凈，加入 2/3 體積異丙醇、1/3體積高鹽溶液，顛倒混勻，-20 ℃放置 1 h。4 ℃、12 000 g離心10 min，棄上清，加入1.0 mL 75%乙醇，靜置3 min，其間顛倒洗滌，4 ℃、12 000 g離心3 min，棄掉液體，吸干殘留的乙醇，將沉淀置于超凈工作臺(tái)上吹干，用 30 μL RNase-free 水溶解RNA沉淀。

1.3總RNA的完整性及質(zhì)量檢測(cè)

取4 μL RNA樣品在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，120 V 穩(wěn)壓，待溴酚藍(lán)到達(dá)膠面1/2位置時(shí)，用紫外凝膠呈像系統(tǒng)拍照記錄。

采用Eppendorf核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)純化好的RNA樣品進(jìn)行濃度及吸光度測(cè)定，分別記錄D260 nm/D280 nm值、RNA濃度，并計(jì)算RNA產(chǎn)率。RNA產(chǎn)率（μg/g）=RNA濃度（μg/mL）×體積（mL）/樣品質(zhì)量（g）[8]。

1.4RT-PCR檢測(cè)

取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄，具體方法參照TaKaRa Primer ScriptTM First Stand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以洋蔥β-actin基因（引物為5′-ACACGGCCTGGATAGCAACAT-3′、5′-AGAGCAGTATTCCCAAGCATT-3′）為內(nèi)參基因[8]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 （10 μL）：5 μL Premix Taq酶（TaKaRa），各0.5 μL 10 μmol/L上、下游引物，0.5 μL 10 ng/μL cDNA，3.5μL ddH2O。PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35次循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃條件保存。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為337 bp。

2結(jié)果與分析

2.1不同方法提取的洋蔥RNA的凝膠電泳分析

以洋蔥根、鱗莖、葉片為試驗(yàn)材料提取總RNA，由圖1可見(jiàn)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，除了TIANGEN試劑盒不能提取洋蔥根的總RNA，其他方法在洋蔥不同組織處均可提取到不同質(zhì)量的RNA。對(duì)于洋蔥葉來(lái)說(shuō)，用TIANGEN試劑盒法、Trizol 法、pBIOZOL法所提取的RNA在28S rRNA、18S rRNA條帶處較暗，2條條帶的亮度相當(dāng)，且有拖尾，說(shuō)明RNA有降解，存在蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染；TaKaRa試劑盒所提總RNA較完整，且條帶清晰。對(duì)于洋蔥根來(lái)說(shuō)，TRIzol法、TaKaRa試劑盒法所提取的RNA在28S rRNA、18S rRNA條帶處較暗，pBIOZOL法所提總RNA較完整，且條帶清晰。對(duì)于洋蔥鱗莖來(lái)說(shuō)，TaKaRa試劑盒與TIANGEN試劑盒所提取的RNA18S rRNA比28S rRNA更亮，說(shuō)明提取過(guò)程中發(fā)生降解和多糖污染；Trizol法條帶弱，濃度低；pBIOZOL法無(wú)拖尾現(xiàn)象，RNA完整性好，純度高。通過(guò)對(duì)比得出，TaKaRa試劑盒法適合洋蔥葉片，pBIOZOL法適合洋蔥鱗莖和根總RNA的提取。

2.2不同方法提取洋蔥RNA質(zhì)量濃度和純度的檢測(cè)

由表1可知，用TaKaRa試劑盒提取的洋蔥葉、鱗莖、根總RNA質(zhì)量濃度分別為342.31、295.06、120.64 μg/mL，D260 nm/D280 nm值均較大，表明有一定程度降解。TIANGEN試劑盒法提取的洋蔥葉、鱗莖、根總RNA質(zhì)量濃度分別為24305、160.04、4.95 μg/mL，其中由于鱗莖、根總RNA的濃度太低，不能用于后續(xù)試驗(yàn)。在所有提取洋蔥葉組織總RNA的方法中，TaKaRa試劑盒法最高，為 342.31 μg/mL。pBIOZOL法提取洋蔥鱗莖、根組織總RNA的質(zhì)量濃度分別為 1 119.39、171.85 μg/mL。純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行后續(xù)分子生物分析的基礎(chǔ)[9]。通過(guò)對(duì)各種參數(shù)進(jìn)行比較后表明，TaKaRa試劑盒最適合提取洋蔥葉片總RNA；pBIOZOL法適合提取洋蔥鱗莖、根的總RNA。

2.3RT-PCR檢測(cè)mRNA的質(zhì)量

將TaKaRa試劑盒提取的洋蔥葉組織RNA、pBIOZOL法提取的洋蔥鱗莖和根總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT-PCR，以驗(yàn)證所提RNA能否滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，2種提取方法對(duì)于洋蔥不同組織提取的RNA能夠滿(mǎn)足后續(xù)分子試驗(yàn)對(duì)樣品品質(zhì)的需求詳見(jiàn)圖2。

3討論與結(jié)論

不同的植物RNA提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，同一種提取方法在不同植物或同種植物不同組織上的可利用性也有差異[10]。傳統(tǒng)提取RNA的方法有CATB法、SDS法等，這些方法對(duì)微生物和動(dòng)物組織的RNA提取效果良好，但是操作較為繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)含有多糖類(lèi)、酚類(lèi)物質(zhì)的高等植物效果不明顯，因此本研究未予以考慮。洋蔥各種組織，尤其是葉片、鱗莖中含有豐富的多糖及各類(lèi)次生代謝物，由于相似的理化性質(zhì)，很難將多糖與RNA分開(kāi)，導(dǎo)致RNA質(zhì)量差、易降解，最終會(huì)使反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)受到抑制[11-12]。因此，去除多糖、次生代謝物質(zhì)對(duì)于洋蔥總RNA提取至關(guān)重要。

本研究采用4種方法提取洋蔥不同組織的總RNA，結(jié)果表明：這4種RNA提取方法對(duì)儀器設(shè)備的要求相同，均較為簡(jiǎn)便，用時(shí)都約為2 h。在4種提取方法中，就提取同樣量 RNA 而言，TaKaRa試劑盒提取法最昂貴，其次是TIANGEN試劑盒法，而TRIzol、pBIOZOL法則較為低廉。采用TaKaRa試劑盒能夠快速高效地提取洋蔥葉片的總RNA，RNA回收效率高；pBIOZOL法適合提取洋蔥鱗莖和根的總RNA，并且RNA純度較高，能有效去組織中的多糖。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)試驗(yàn)篩選得到的最優(yōu)方法所提取的洋蔥各組織總RNA完全能夠滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。本研究在結(jié)合相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，篩選出適合洋蔥葉片、鱗莖和根總RNA提取的最佳方法，為后續(xù)的分子生物學(xué)研究提供了方法借鑒，同時(shí)也為蔥屬其他植物提取RNA提供了一定參考。

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