陶虎++索效軍++李曉峰++熊琪++張年++楊前平++劉洋++陳明新

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.016

摘要：繁殖力是決定羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)效益最重要的因素，卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育決定了排卵數(shù)，進(jìn)而直接影響母羊的繁殖力。miRNA是由內(nèi)源性基因編碼的單鏈非編碼RNA，參與靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本研究通過(guò)對(duì)山羊miR-27a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)及功能分析，為進(jìn)一步研究其在山羊繁殖功能中的作用提供新途徑。利用靶基因預(yù)測(cè)軟件分析miR-27a的靶基因，將靶基因進(jìn)行GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)靶基因集合分別富集在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)控RNA代謝、正調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)等分子功能上以及ErbB、MAPK、mTOR等信號(hào)通路中。

關(guān)鍵詞：山羊；miR-27a；靶基因；信號(hào)通路；GO分析

中圖分類號(hào)： S827.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0073-03

收稿日期：2016-04-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31501932）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金（編號(hào)：2015NKYJJ14）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競(jìng)爭(zhēng)性計(jì)劃（編號(hào)：2016jzxjh030）。

作者簡(jiǎn)介：陶虎（1986—），男，安徽合肥人，博士，助理研究員，主要從事草食家畜分子育種研究。Tel：（027）87380139；E-mail：taohu1986@hotmail.com。

通信作者：陳明新，研究員，主要從事草食家畜育種研究。E-mail：316824556@qq.com。我國(guó)是養(yǎng)羊大國(guó)，羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在畜牧業(yè)中占有重要地位。繁殖和生長(zhǎng)是決定規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)出的兩大主要經(jīng)濟(jì)性狀。在山羊中，母羊繁殖效益在總效益中占據(jù)較大比例，因此繁殖力是決定羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)效益最重要的因素之一。排卵率是產(chǎn)仔數(shù)性狀的重要組分性狀，卵巢中卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育決定了排卵數(shù)[1]。探索卵巢中的基因表達(dá)情況、發(fā)育規(guī)律、調(diào)控因素，對(duì)于揭示排卵率的遺傳調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

microRNA（miRNA）是由內(nèi)源性基因編碼的單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度一般為21～25個(gè)核苷酸（nucleotide，nt），通過(guò)與靶基因mRNA的3′-UTR互補(bǔ)配對(duì)來(lái)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平[2]。已有研究表明，miR-21、miR-212、miR-132在小鼠顆粒細(xì)胞中呈顯著的上調(diào)表達(dá)，且當(dāng)miR-21表達(dá)量降低時(shí)會(huì)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡[3]。在小鼠顆粒細(xì)胞中篩選出多個(gè)受TGF-β1信號(hào)調(diào)控的miRNA，其中miR-224可靶向作用于Smad4基因來(lái)調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖[4]。前體miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)經(jīng)Dicer加工形成成熟的miRNA[5]。Dicer1-/-雌鼠的卵母細(xì)胞中紡錘體發(fā)生異常，導(dǎo)致其不能完成第1次減數(shù)分裂[6-7]。對(duì)于顆粒細(xì)胞而言，miRNA是一類發(fā)揮重要調(diào)控作用的小分子調(diào)控物。miR-27a是miR-27家族的重要成員，該家族是 miRNA 中功能較為明顯的家族之一。眾多研究表明，miR-27a在疾病尤其在腫瘤中發(fā)揮重要作用，而在生殖領(lǐng)域鮮見報(bào)道。研究miR-27a及其靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)進(jìn)一步揭示miRNA對(duì)山羊母性繁殖的調(diào)控作用具有重要意義。

1材料與方法

1.1獲取miRNA

從miRNA信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase（http：//www.mirbase.org/）中獲取不同物種的miR-27a前體序列和成熟序列。

1.2同源性比對(duì)

利用miR-27a的前體序列，比較前體序列在不同物種間的保守程度。利用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，運(yùn)用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）軟件制作不同物種間miR-27a前體序列的進(jìn)化樹。

1.3靶基因預(yù)測(cè)

分別利用miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）、miRDB（http：//mirdb.org/miRDB/index.html）、TargetScan（http：//www.targetscan.org/）等靶位點(diǎn)分析軟件分析miR-27a的靶基因和靶位點(diǎn)的保守性。將結(jié)果的交集作為進(jìn)一步研究的基因集合，篩選3個(gè)軟件均能預(yù)測(cè)到且在4種物種中均保守的靶基因作為候選靶基因。通過(guò)分析靶基因的功能進(jìn)一步分析miR-27a的生物學(xué)功能。

1.4靶基因的分析

利用Gene Ontology（http：//geneontology.org/）、DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)得到的miR-27a靶基因進(jìn)行功能富集分析，利用KEGG（http：//www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路分析，預(yù)測(cè)結(jié)果在GO類別上的高頻率注釋以及有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)調(diào)控通路。

2結(jié)果與分析

2.1miR-27a序列的獲得和同源性比對(duì)

利用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到miR-27a的成熟序列，利用Clustal X在線軟件進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列在人、小鼠、大鼠、豬、馬中完全一致，在牛、山羊、狗中只相差最后1個(gè)堿基，因此miR-27a的成熟序列具有很高的保守性（圖1）。利用Clustal Omega軟件分析上述物種的miR-27a前體序列，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠、大鼠、豬的miR-27a前體序列比較接近，牛與山羊的比較接近（圖2）。

2.2miR-27a靶基因預(yù)測(cè)

利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda、miRDB、TargetScan（表1）進(jìn)行靶基因聯(lián)合預(yù)測(cè)，分別得到miR-27a靶基因?yàn)? 902、697、786個(gè)。篩選3種軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集（共390個(gè)），作為進(jìn)一步分析的基因集合（圖3）。

3結(jié)論與討論

miRNA是一種非編碼的小RNA，通過(guò)與靶基因3′-UTR特異性結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞周期、基因表達(dá)、生殖發(fā)育等過(guò)程中具有重要作用[8]。miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)至今已收錄的miRNA達(dá)24 521條，為本研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，miRNA的研究已取得了很大進(jìn)展，對(duì)于各種生命活動(dòng)的調(diào)控作用也進(jìn)行了大量研究。GO富集分析、KEGG信號(hào)通路分析等生物信息學(xué)分析技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)miRNA的研究起到了關(guān)鍵性的支持作用，幫助研究者從海量的miRNA數(shù)據(jù)中篩選出有價(jià)值的信息。Gene Ontology可分為分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞組成3個(gè)部分。蛋白質(zhì)或基因可通過(guò)ID對(duì)應(yīng)或序列注釋的方法找到與之對(duì)應(yīng)的GO號(hào)，從而進(jìn)行功能類別或細(xì)胞定位[9]。KEGG信號(hào)通路分析能夠?qū)⑻囟╩iRNA靶基因的信號(hào)通路進(jìn)行整合歸類，也可設(shè)定相關(guān)參數(shù)，根據(jù)實(shí)際需要對(duì)結(jié)果進(jìn)行提取[10]。

miR-27a研究的常規(guī)思路是通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（miRGen、TargetScan等），利用已知的miRNA來(lái)預(yù)測(cè)下游靶基因。利用上述預(yù)測(cè)手段得到可能與之作用的miRNA，通過(guò)合成miRNA的類似物和抑制物，與所構(gòu)建靶基因的熒光載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確定能夠被miR-27a顯著下調(diào)的靶基因，從而完成驗(yàn)證。

miR-27a的靶基因參與了細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)控RNA代謝、正調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)等一系列重要的生命活動(dòng)過(guò)程，預(yù)示miR-27a在山羊繁殖過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。

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