張偉++陳章言++王利紅+++仝蒙

摘要：為深入探討豬核糖體蛋白L10a假基因（RPL10a pseudogene）的多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)性狀間的相關(guān)性，采用聚合酶鏈式反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）檢測方法，分析蘇姜豬RPL10a假基因第2個外顯子區(qū)的多態(tài)性。檢測結(jié)果顯示：引物P1擴增區(qū)存在AA和AB等2種基因型，引物P4擴增區(qū)存在4種SSCP型；經(jīng)核酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，在27 389 415、27 389 835、27 389 946位分別存在C→G、G→A、A→G的突變，27 389 851位為堿基A的插入突變。經(jīng)群體遺傳學分析，各基因分布符合哈迪-溫伯格定律，處于群體平衡狀態(tài)。將各基因型與蘇姜豬5個胎次的平均產(chǎn)仔數(shù)進行相關(guān)性統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，RPL10a假基因引物P1和P4各擴增區(qū)不同SSCP類型與蘇姜豬平均產(chǎn)仔數(shù)性狀間無顯著差異（P>0.05）。將2個擴增區(qū)不同SSCP型綜合分析，結(jié)果顯示，同時存在AB型與SSCP-1型蘇姜豬的第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)顯著高于同時具有AA型與SSCP-1、SSCP-2型的蘇姜豬（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：蘇姜豬；RPL10a假基因；PCR-SSCP；產(chǎn)仔數(shù)

中圖分類號：S828.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0062-04

收稿日期：2016-02-23

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2014381）；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院院級課題（編號：NSFPT201505）。

作者簡介：張偉（1973—），男，高級畜牧師，主要從事動物遺傳繁育研究。E-mail：hdjgzhangwei001@163.com。核糖體是所有生物細胞中合成蛋白質(zhì)的重要細胞器，由蛋白質(zhì)和RNA組成。真核生物的核糖體約有80種核糖體蛋白亞基[1]，分為大亞基和小亞基。大亞基（60S）核糖體蛋白命名為L1-L44，小亞基（40S）核糖體蛋白命名為S1-S31[2-3]。核糖體蛋白L10a（ribosomal protein L10a，RPL10a）即屬于核糖體60S大亞基的蛋白[4]。核糖體蛋白的功能較多，不僅在蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮作用，還參與復制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復等過程，在細胞增殖、凋亡、發(fā)育的多種調(diào)控和惡性轉(zhuǎn)化等方面也發(fā)揮著重要作用[2]。隨著生物基因組研究的不斷深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種生物存在假基因，即所謂的“垃圾”DNA，其中包括很多看家基因，如肌動蛋白、微管蛋白、金屬硫蛋白、免疫球蛋白、核糖體等。這些假基因可通過DNA調(diào)控或RNA調(diào)控方式，調(diào)節(jié)同源功能基因的表達、蛋白翻譯、基因沉默等[5]。目前，對假基因的檢測分析已成為生物進化及基因調(diào)控研究的新熱點。本研究首次檢測分析位于10號染色體的豬RPL10a假基因第2外顯子的多態(tài)性，并分析其與產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性，為深入探討豬RPL10a假基因的功能、擴展豬分子輔助選育研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

隨機選取50頭蘇姜豬母豬，剪取耳組織，采用酚-三氯甲烷抽提法提取組織中的DNA，用超純水稀釋至100 ng/μL，于 -20 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物設(shè)計與PCR擴增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中豬RPL10a假基因NC_010452.3第2個Exon的核酸信息，采用Primer premiers 5.0軟件設(shè)計4對引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3PCR-SSCP分析

樣本DNA擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54～56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR擴增后，將產(chǎn)物進行變性處理，采用12%非變性聚丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺（29 ∶1）凝膠電泳 8～12 h，銀染顯帶并拍照分析，將不同基因型PCR產(chǎn)物送至上海基康生物技術(shù)有限公司測序。

1.4統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗分析。

2結(jié)果與分析

2.1RPL10a假基因第2外顯子與RPL10a功能基因序列相似度分析

采用GenBank網(wǎng)站的BLAST軟件比對分析RPL10a假基因第2外顯子與RPL10a功能基因核酸序列（表2）。結(jié)果顯示，RPL10a假基因有5處核酸序列區(qū)段與功能基因的5個外顯子相似（RPL10a基因有6個外顯子），且相似度較高，表明RPL10a假基因第2外顯子區(qū)可作為分析假基因調(diào)控功能基因表達的主要區(qū)段。

2.2引物P1～P4 PCR擴增結(jié)果

將RPL10a假基因4對引物PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）檢測，電泳條帶清晰，表明引物P1～P4 PCR擴增特異性好。將PCR擴增產(chǎn)物測序后，進行NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST分析，結(jié)果顯示，所擴增序列與豬（Sus scrofa）RPL10a假基因第2個外顯子序列有高度相似性，分別為98%、99%、99%、98%，表明本試驗擴增的核酸序列位于所檢測基因區(qū)。

2.3PCR-SSCP分析結(jié)果

將RPL10a假基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析，結(jié)果顯示，引物P1擴增產(chǎn)物存在2種SSCP條帶類型，分別為AA型和AB型（圖2）；引物P2、P3擴增產(chǎn)物不存在單鏈構(gòu)象多態(tài)性（圖3）；引物P4擴增產(chǎn)物存在4種SSCP條帶類型（圖4）。

2.4引物P1、P4擴增產(chǎn)物不同基因型序列分析

引物P1的不同PCR-SSCP樣本經(jīng)核酸序列測定并與NC_010452.3比對分析，結(jié)果顯示，在27 389 415位存在 C→G 的突變（圖5）。

將引物P4的不同PCR-SSCP樣本經(jīng)核酸序列測定并與NC_010452.3比對分析，結(jié)果顯示，在27 389 835、27 389 946位分別存在G→A、A→G的突變，27 389 851位存在堿基A的插入（圖6）。

2.5蘇姜豬RPL10a假基因群體遺傳分析

蘇姜豬RPL10a假基因引物P1、P4擴增區(qū)不同SSCP型頻率以及基因頻率見表3、表4。由表3可知，引物P4擴增區(qū)SSCP-1型所占比例最高，為50%，SSCP-4個體數(shù)最少，僅占6%；由表4可知，27 389 415、27 389 835、27 389 946堿基突變位點均為野生純合型高于雜合型，但均未在蘇姜豬群體中檢測到突變純合型。根據(jù)哈迪-溫伯格定律，經(jīng)卡方檢驗各基因群體平衡性（表5），結(jié)果表明，2對引物擴增區(qū)在 27 389 415、27 389 835、27 389 946位點的堿基突變均未達到統(tǒng)計學差異顯著級別（P>0.05），表明各基因分布符合哈迪-溫伯格定律，處于群體平衡狀態(tài)。

2.6蘇姜豬RPL10a假基因不同SSCP型與產(chǎn)仔數(shù)間的相關(guān)性分析

對有產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)記錄的蘇姜豬進行5個胎次的平均產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計分析，結(jié)果（表6、表7）表明，RPL10a假基因引物P1、P4擴增區(qū)不同SSCP類型的平均產(chǎn)仔數(shù)性狀間無顯著差異（P>0.05）。綜合分析引物P1、P4擴增區(qū)不同SSCP類型，結(jié)果（表8）表明，同時存在AB型與SSCP-1型的蘇姜豬第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)顯著高于同時具有AA型與SSCP-1、SSCP-2型的蘇姜豬（P<0.05），其他類型的各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

隨著現(xiàn)代生物科技的快速發(fā)展，現(xiàn)已通過基因組測序和轉(zhuǎn)錄過程中mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA的方式重新整合進入基因組，在生物長期進化選擇過程中由于隨機突變積累而喪失功能[5]。本研究通過PCR-SSCP 方法檢測到

引物擴增區(qū)突變位點（位）χ2值P127 389 4152.75P427 389 8350.2027 389 9465.56注：“*”表示在0.05水平下差異顯著，未標注者為差異不顯著（P>0.05）；χ2（2，0.05）=5.99。

基因克隆鑒定技術(shù)發(fā)現(xiàn)生物體基因組中存在大量的假基因，如人類基因組中約97%為非表達序列，即所謂的“垃圾”DNA[5]。假基因的產(chǎn)生主要有2種類型，一種是正?；虻膹椭苹蚧蛑g的不平衡交換，產(chǎn)生點突變、插入、缺失、移碼突變等，導致復制后的基因無法進行正常編碼；另一種類型是蘇姜豬群體中RPL10a假基因第2個外顯子區(qū)存在多態(tài)性，經(jīng)序列比對，在27 389 415、27 389 835、27 389 946位點存在C→G、G→A、A→G堿基突變，在27 389 851位點檢測到堿基表6引物P1不同PCR-SSCP類型蘇姜豬各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)

SSCP類型各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)（頭）第1胎第2胎第3胎第4胎第5胎AA9.47±2.91（30）11.21±2.92（28）9.94±1.98（17）11.29±2.31（17）11.69±2.72（13）AB11.61±2.71（18）11.22±2.37（18）10.71±2.46（14）11.00±2.31（13）11.64±2.37（14）注：同一胎次不同SSCP類型間，數(shù)據(jù)后未標字母和字母相同者表示在0.05水平下差異無統(tǒng)計學意義，字母不同者表示在0.05水平下差異顯著。下表同。

A的插入突變，表明豬RPL10a假基因的產(chǎn)生符合假基因產(chǎn)生的第1種類型。通過群體遺傳學分析突變位點各基因頻率的平衡性，發(fā)現(xiàn)各基因頻率均符合哈迪-溫伯格定律，表明這些基因在蘇姜豬群體中已處于群體平衡狀態(tài)。

2003年，日本研究小組發(fā)現(xiàn)第1個有功能的假基因，并培育出插入makorin1基因的變異體，即makorin1-p1的假基因（致死基因）小鼠；該假基因不編碼蛋白質(zhì)，但當其損壞后對應(yīng)的真基因也不工作，最終導致小鼠死亡[6]，表明假基因表7引物P4不同PCR-SSCP類型蘇姜豬各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)

表8同。

在生物體內(nèi)具有重要的調(diào)控機能。此后，有關(guān)假基因的研究報道進一步證實，假基因的作用具有序列專一性，只影響與基因本身相似的序列，通過DNA和RNA指導調(diào)控功能基因的表達，參與基因沉默、催化、發(fā)育調(diào)控等[5]。RPL10a基因表達核糖體60S大亞基上的蛋白，不僅在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用，還參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，調(diào)控細胞增殖、凋亡、分化等。已有研究報道，RPL10a蛋白基因突變與自閉癥的發(fā)病機制有關(guān)[7-8]。豬RPL10a基因位于第10號染色體，有6個外顯子，而RPL10a假基因位于第7號染色體，有2個外顯子。通過比對功能基因和假基因第2外顯子核酸序列，發(fā)現(xiàn)有5個相似區(qū)均位于功能基因的外顯子區(qū)，表明RPL10a假基因可能參與功能基因的表達調(diào)控過程。本研究檢測出的蘇姜豬RPL10a假基因27 389 415、27 389 835位點的突變，對應(yīng)于功能基因第1、第4外顯子區(qū)內(nèi)，但在蘇姜豬群體中均未檢測到突變純合型，表明RPL10a假基因上述突變位點的突變純合型可能會影響功能基因的表達，進而導致個體生理功能異常，使胚胎早期死亡。27 389 946、27 389 851位點均不對應(yīng)于功能基因的外顯子區(qū)，雖然27 389 851位點為堿基插入突變，可能不會影響功能基因的表達，但具體的調(diào)節(jié)機制有待后續(xù)研究。

為深入研究假基因的功能，近年來，通過SSCP方法開展假基因多態(tài)性與生物性狀間相關(guān)性的研究也逐步增加，如楊愛初等對多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶假基因多態(tài)性與苯中毒的相關(guān)性進行了研究[9]，以及唐錄英等對聚腺苷二磷酸核糖聚合酶假基因多態(tài)性分布及其與肺癌易感性關(guān)系進行了研究等[10]。本研究將PCR-SSCP方法檢測獲得的蘇姜豬RPL10a假基因第2外顯子區(qū)多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)性狀進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，不同SSCP型同一胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間差異不顯著（P>0.05）。以蘇姜豬個體為對象，將引物P1和P2不同SSCP多態(tài)性進行綜合分析，在檢測出的6頭 SSCP-3型蘇姜豬個體中無一兼具AA型，表明27 389 415位點的堿基突變與其他3個突變位點間可能存在一定影響，特別是27 389 835位點的突變影響可能較大；27 389 415、27 389 835 位點均對應(yīng)于功能基因第1、第4外顯子區(qū)內(nèi)，表明與RPL10a功能基因外顯子區(qū)相對應(yīng)的假基因核酸序列上的堿基突變，對功能基因的表達可能存在影響。對各類型蘇姜豬同一胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間的差異顯著性進行檢驗，結(jié)果表明，兼有AB型與SSCP-1型的蘇姜豬第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)[（12.30±1.70）頭]顯著高于兼有AA型與SSCP-1[（9.62±2.14）頭]、SSCP-2型[（9.33±3.68）頭]的蘇姜豬（P<0.05），其他類型的各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間差異不顯著（P>0.05）?？梢姡?7 389 415位點堿基突變可能與其他位點的堿基變化具有協(xié)同作用，共同影響蘇姜豬產(chǎn)仔數(shù)性狀，但RPL10a假基因影響功能基因表達進而影響豬繁殖力性狀的機制有待進一步深入研究。

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