田 晶，田浩楷，刁紅亮，付淑慧，郝 赤，馬瑞燕*

（1.呂梁學院生命科學系，山西離石033000；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

玫煙色棒束孢對煙粉虱致病的時間-劑量-死亡率模型分析

田 晶1，2，田浩楷2，刁紅亮2，付淑慧2，郝 赤2，馬瑞燕2*

（1.呂梁學院生命科學系，山西離石033000；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

為了尋找煙粉虱生物防治的新途徑，用浸葉法測定了生防菌玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱各蟲態(tài)的致病力。結果表明，接種該菌株孢子懸浮液后煙粉虱各蟲態(tài)均可被感染而發(fā)病死亡。在供試濃度（1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105、1.0×105cfu/m L）處理下，煙粉虱各蟲態(tài)的累計校正死亡率均隨著孢子懸浮液濃度的增加和時間的延長而升高。2齡若蟲的累計校正死亡率最高，在濃度為1.0×107cfu/m L的孢子懸浮液處理7 d后達到83.05%。運用時間-劑量-死亡率模型對生物測定數(shù)據(jù)進行擬合，并估計了該菌株對煙粉虱的致死劑量與致死時間。隨著接種天數(shù)的增加，煙粉虱各蟲態(tài)的致死中濃度（LD50）和死亡率為90%所對應的濃度（LD90）降低，生防菌的劑量效應逐漸增強，2齡若蟲在接種后7 d的LD50對數(shù)劑量估計值為4.37。生防菌的致死時間與劑量呈負相關，在1.0×105～1.0×107cfu/m L內隨生防菌濃度的增加2齡若蟲的致死中時（LT50）由5.66 d降到4.47 d。玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱2齡若蟲有較高的致病效果，是煙粉虱生物防治的潛力菌株。

玫煙色棒束孢；煙粉虱；致病力；時間-劑量-死亡率模型；生物防治

煙粉虱（Bem isia tabaci）是一種重要的世界性害蟲［1］，屬于對農業(yè)危害較大的100種入侵害蟲之一［2-3］。施用化學藥劑是防治煙粉虱的主要方法之一，但大量化學農藥的施用使煙粉虱對許多殺蟲劑產生了抗藥性，且抗性不斷增強［4-5］。煙粉虱僅以刺吸式口器吸取作物汁液進行危害，細菌、病毒等需要通過消化道才能進入體內的生物殺蟲劑無法對煙粉虱發(fā)揮作用，而蟲生真菌可直接穿透寄主的表皮進入體內起作用［6］，是防治煙粉虱這類刺吸式口器害蟲比較理想的生物制劑。

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）是一種重要的昆蟲病原真菌，分布廣泛［7-9］。在比利時等國家已被開發(fā)成微生物殺蟲劑，用來防治煙粉虱［10］。山西農業(yè)大學生物安全與生物防治研究室在田間分離到1株玫煙色棒束孢，該菌株對人畜安全［11］，且對煙粉虱的致病力較強［12-14］。本研究采用時間-劑量-死亡率（TDM）模型對玫煙色棒束孢侵染煙粉虱的致病力進行分析，該模型將時間和劑量效應統(tǒng)一于一個模型內，可考察時間與劑量效應的互作，能夠體現(xiàn)出毒力測定數(shù)據(jù)的直觀性和客觀性，以便進一步探索和研究該菌株對煙粉虱的毒力作用，從而為其今后在農業(yè)生產中應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

玫煙色棒束孢IF-1106菌株，分離自山西省太谷縣溫室大棚中，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.7514。

將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板上，放入25℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，加入20 m L含0.1%吐溫-80的無菌水，用接種針輕刮真菌的菌絲和孢子從而收集玫煙色棒束孢的分生孢子。將菌液倒入燒杯中，用磁力攪拌器將分生孢子打散（約30 min），用4層無菌紗布過濾到小燒杯中即得到孢子懸浮液，棄去培養(yǎng)基殘物和雜質。再用血球計數(shù)板計數(shù)，計算母液的孢子濃度。計數(shù)后先將孢子懸浮液稀釋到1.0×107cfu/m L，再分別稀釋為5.0×106、1.0 ×106、5.0×105、1.0×105cfu/mL。

1.2 供試昆蟲

煙粉虱來源于山西省太谷縣溫室大棚中，經(jīng)鑒定生物型為B型。根據(jù)煙粉虱在黃瓜上的發(fā)育歷期［15］，在其產卵后選取均勻一致的各蟲態(tài)備用。

1.3 玫煙色棒束孢對煙粉虱的致病力測定

對若蟲的致病力測定［16-18］：采用浸葉法，將帶有煙粉虱1、2、3齡若蟲的黃瓜葉片分別浸入不同濃度（1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105、1.0×105cfu/ m L）的玫煙色棒束孢孢子懸浮液中，處理20 s后取出，放在干凈的濾紙上將多余的水分吸干。每處理1片葉，每葉30頭蟲，重復6次，以含0.1%吐溫-80的無菌水處理為對照。試驗葉片的葉柄需包被浸有營養(yǎng)液的棉花團，以保證葉片至少能保持7 d的活性。將試驗葉片放入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封口并扎孔以透氣，然后放入溫度（25.0±0.5）℃、光照14 h/d的光照培養(yǎng)箱中，調節(jié)光照培養(yǎng)箱的相對濕度在80%左右。每天鏡檢一次，記錄死亡蟲數(shù)，連續(xù)觀察7 d。若蟲上密布菌絲，或顏色從透明變成不透明的白或淡黃色，可認為死亡。

對成蟲的致病力測定［16，18］：在培養(yǎng)皿中加入不同濃度（1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105、1.0× 105cfu/m L）的玫煙色棒束孢孢子懸浮液，將黃瓜頂部真葉浸入懸浮液中，將發(fā)育期一致的煙粉虱成蟲在-4℃的冰箱中冷凍15 s后，輕輕拍入皿內，每皿接入成蟲10頭（不分雌雄），然后將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中，條件設定為（25.0±0.5）℃、相對濕度80%、14 h光/10 h暗。每個處理3皿，每皿10頭，共30頭成蟲，重復6次，以含0.1%吐溫-80的無菌水處理為對照。由于相對濕度較大，對照的死蟲數(shù)也較多，因此，需要將處理和對照中每天死亡的成蟲移除，并保濕培養(yǎng)，只有成蟲上有菌絲長出，才能確定是由致病菌侵染致死，連續(xù)觀察7 d。

根據(jù)每天觀察到的平均活蟲數(shù)與死蟲數(shù)計算各處理的死亡率，并以Abbott公式計算校正死亡率［19］：校正死亡率=［（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）］×100%。

1.4 模型模擬分析

對生物測定數(shù)據(jù)采用時間-劑量-死亡率模型模擬方法進行分析［20］，該模型表述如下：

式（1）中，β表示劑量效應的斜率，τj是到時間tj的時間效應參數(shù)，Pij是劑量di在第j個時間單位內產生的累計死亡概率。

由于累計死亡概率在時間上是連續(xù)的，若直接擬合則不符合模型模擬變量的獨立性假設，因此考慮劑量di使試蟲在時間區(qū)間［tj-1，tj］內可能遭受的死亡率即條件死亡概率，其可表示為：

式（2）中，β的含義與式（1）中相同，γj為描述時間區(qū)間［tj-1，tj］內時間效應的待估參數(shù)，與τj在時間的含義上有所區(qū)別。式（2）可進行模型擬合，獲得參數(shù)

所有模擬及運算過程均采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件完成，模擬中各濃度下的死亡數(shù)據(jù)以對照中的自然死亡數(shù)進行校正。

2 結果與分析

2.1 不同濃度玫煙色棒束孢IF-1106菌株處理后煙粉虱逐日死亡情況

由圖1可知，隨孢子懸浮液接種濃度的增加，煙粉虱若蟲和成蟲的死亡率也增加（成蟲是從接種后第4天開始死亡，故記錄了第4～10天的數(shù)據(jù)）。在孢子濃度為1.0×107cfu/m L時，1、2、3齡若蟲處理7 d后的累計校正死亡率分別為78.38%、83.05%、45. 72%，成蟲處理10 d后的累計校正死亡率為54.98%?？梢姡瑹煼凼?齡若蟲對玫煙色棒束孢感病死亡率最高。死亡的若蟲和成蟲表現(xiàn)典型的蟲生真菌致死癥狀，蟲體保濕培養(yǎng)后體表都有菌絲長出。

2.2 玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱各蟲態(tài)致病的TDM模型模擬

將圖1中的數(shù)據(jù)導入TDM模型進行模擬分析，數(shù)據(jù)顯示（表1），1、2、3齡若蟲及成蟲劑量效應的斜率β分別為0.331 8、0.336 6、0.405 6、0.400 1，說明3齡若蟲對孢子懸浮液濃度的增加最為敏感，之后依次為成蟲、2齡若蟲、1齡若蟲。累積時間效應參數(shù)τj隨時間推移而增大，但在試驗接近尾聲時變化幅度減小，說明煙粉虱累計死亡率除受劑量因素影響外還受到作用時間的影響，隨接種天數(shù)的增加煙粉虱死亡率的增速逐漸上升后趨于穩(wěn)定。條件死亡率模型中各處理劑量與時間效應參數(shù)的t測驗值均達到顯著或極顯著水平，即標準誤差相對于參數(shù)估計值極小，說明供試菌株的劑量效應與時間效應顯著。其中，時間效應參數(shù)可估計煙粉虱各蟲態(tài)的死亡高峰，其在1齡和3齡幼蟲接種后第6天（γ6）、2齡若蟲接種后第5天（γ5）、成蟲接種后第7天（γ7）達到最大，與試驗觀察到的死亡高峰期相吻合。

所建條件死亡率模型的Hosmer-Lemeshow擬合度測試結果見表2。已知d f=8時，由于1、2、3齡若蟲及成蟲的χ2分別為1.332 9、2.677 0、3.172 7和2.609 8，均小于，各模型均通過擬合異質性檢驗，表明所建模型均不存在異質性，即它們能夠無偏描述不同濃度處理下玫煙色棒束孢與煙粉虱不同蟲態(tài)間的互作關系。

2.3 玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱各蟲態(tài)致死的劑量效應

根據(jù)TMD模型估計玫煙色棒束孢IF-1106菌株接種煙粉虱各蟲態(tài)的劑量效應值，有效致死劑量是一個時間相關函數(shù)，由模型參數(shù)τ和β確定。從劑量效應值的變化來看（圖2），隨著接種天數(shù)的增加，各蟲態(tài)的致死中濃度（LD50）和死亡率為90%所對應的濃度（LD90）降低，菌株的劑量效應逐漸增強。玫煙色棒束孢對煙粉虱各蟲態(tài)的劑量效應整體呈現(xiàn)為在接種后的前5 d變化明顯，反映出這期間死亡率變化較大，此后變化減小并趨于穩(wěn)定。從LD50和LD90的變化范圍來看，2齡若蟲隨時間的推移下降范圍最大，成蟲最小。各齡若蟲接種后7 d和成蟲接種后10 d的LD50對數(shù)劑量估計值分別為4.73、4.37、7.43、6.83，LD90對數(shù)劑量估計值分別為8.34、7.94、10.39、9.83。由于3齡若蟲實際累計最高死亡率未達到50%，因此模型估計的LD50偏大，并且試驗中各蟲態(tài)的實際累計死亡率均未達到90%，模型估計的LD90也會偏大。該結果表明，達到同一致死水平的時間越長，所需孢子懸浮液的濃度越低。

2.4 玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱各蟲態(tài)致死的時間效應

由DPS數(shù)據(jù)處理軟件處理相關數(shù)據(jù)獲得玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱的致死中時（LT50）。3齡若蟲因為最高濃度下的累計校正死亡率未超過50%，因此無法計算出LT50值，而成蟲只有在高濃度（1.0×107cfu/m L）下才得到LT50為7.63 d。因1、2齡若蟲的累計校正死亡率較高，在各濃度下均計算得到LT50，在孢子懸浮液濃度為1.0× 105～1.0×107cfu/mL時，致死時間與濃度呈負相關趨勢，從低到高不同濃度下1齡若蟲的LT50依次為5.93、5.54、5.19、4.78、4.57 d，2齡若蟲的LT50依次為5.66、5.09、4.91、4.59、4.47 d。由此可見，2齡若蟲致死所需的時間最短。

3 結論與討論

玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱不同蟲態(tài)的致病力測定結果表明，供試昆蟲的不同蟲態(tài)均出現(xiàn)被感染而死亡的現(xiàn)象，其中2齡若蟲的累計校正死亡率最高，3齡若蟲的累計校正死亡率最低，在高濃度孢子懸浮液（1.0×107cfu/m L）接種7 d后死亡率分別為83.05%、45.72%。從劑量效應角度來看，3齡若蟲的β估計值最大，為0.405 6，其后依次為成蟲（0.400 1）、2齡若蟲（0.336 6），可見3齡若蟲對菌株的濃度變化最為敏感。從時間效應角度來看，煙粉虱各蟲態(tài)接種病原真菌后的死亡高峰期大體一致，即主要集中在接種后的第5天和第6天，2齡若蟲致死所需時間最短。將劑量效應和時間效應綜合考慮，初步得出玫煙色棒束孢IF-1106菌株可作為生物防治煙粉虱的優(yōu)良菌株，在2齡若蟲期噴施具有最佳的防治效果。

本試驗結果表明，玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱2齡若蟲的致病力最高，但是從條件死亡率模型的分析結果可得出，其對孢子懸浮液濃度變化的敏感程度小于3齡若蟲及成蟲。該結果反映了2齡若蟲在所設定的不同菌株劑量范圍內，其死亡率相對于其他蟲態(tài)處于較高的數(shù)值且穩(wěn)定增長，進而表明適當濃度的玫煙色棒束孢IF-1106菌株即可造成煙粉虱2齡若蟲大量死亡。有研究表明，蟲生真菌主要從體壁侵入，低齡幼蟲的體壁較薄，真菌孢子容易穿透侵染，但玫煙色棒束孢對1齡若蟲的致病力稍微低于2齡若蟲?？赡苁怯捎?齡若蟲較2齡若蟲的表面積小，致使真菌侵染機會減?。欢啐g幼蟲和成蟲體壁蠟質層增厚，防衛(wèi)機制發(fā)育健全而增強了抗病性，使真菌孢子難以穿透侵染［23-24］。

TDM模型將時間和劑量效應統(tǒng)一到一個模型中，通過模型擬合計算出有效致死劑量與致死時間，比概率值分析更精確地反映真實情況，避免概率值分析中時間效應與劑量效應相互脫節(jié)的問題。2種效應的交互作用體現(xiàn)在：接種不同濃度玫煙色棒束孢孢子懸浮液后，隨著時間的推移，達到一定死亡水平所需的孢子懸浮液濃度會逐漸降低；同樣，隨著劑量的增加，達到有效致死水平的時間會逐漸縮短。因此，LD50隨時間的下降趨勢和LT50隨劑量的下降趨勢可以更加可靠地評價該菌株的應用潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)，在煙粉虱2齡若蟲期噴施玫煙色棒束孢孢子懸浮液具有較好的防治效果，且2齡若蟲對菌株孢子懸浮液濃度的增加不太敏感。實際生產應用時，在能夠達到理想的殺蟲效果下，可以適當降低該菌株生物制劑的濃度及用量，這樣可以提高藥劑的利用率，減少成本。根據(jù)本研究建立的致死濃度與致死時間互為函數(shù)的關系，田間用藥的濃度應當根據(jù)害蟲發(fā)生情況和防治目標的實際需要合理制定，若不過分追求快速擊倒，稍放寬對時間的要求，則菌株制劑的用量可在常規(guī)水平基礎上大幅減少。

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Time-dose-mortality Model of Isaria fumosorosea against Bemisia tabaci（Homoptera：Aleyrodidae）

TIAN Jing1，2，TIAN Haokai2，DIAO Hongliang2，F(xiàn)U Shuhui2，HAO Chi2，MA Ruiyan2*
（1.Department of Life Science，Lüliang University，Lishi033000，China；2.College of Agriculture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

In order to effectively control Bemisia tabaci，the virulence of Isaria fumosorosea IF-1106 isolate against different instars of B.tabaci was evaluated by immersing leaves.Results showed that all states of B.tabaci could die after infection of I.fumosorosea.Under the treatment of I.fumosorosea conidial suspension with the concentration of 1.0×107，5.0×106，1.0×106，5.0×105，1.0×105cfu/m L，the accumulative ad justed mortality of B.tabaci increased with rise of concentration of the conidia and elongation of action time.The accumulative adjusted mortality of 2ndinstar larvaewas the highest among all instars，which reached 83.05%after 7 days of treatment by 1.0×107cfu/m L.A time-dose-mortality model conforming to Hosmer-Lemeshow goodness-of-fit testwas established to estimate the lethal dose and lethal time of Isaria fumosorosea IF-1106 against B.tabaci.With the extension of time，the dose effect increased，LD50and LD90decreased.The estimated LD50logarithm of 2ndinstar larvae on the 7th day after treatment was 4.37.The time effect was negatively correlated to the dose，and the LT50values of 2ndinstar larvaedecreased from 5.66 d to 4.47 d with the increase of the concentration in the range of 1.0×105—1.0×107cfu/m L.I.fumosorosea IF-1106 has high pathogenicity to the 2ndinstar larvae，and is promising in the biological control of B.tabaci.

Isaria fumosorosea；Bemisia tabaci；pathogenicity；time-dose-mortalitymodel；biological control

S476.12

A

1004-3268（2017）01-0070-06

2016-06-14

呂梁學院校內基金項目（ZRXN201409）；山西省煤基重點科技攻關項目（FT201402）；北京農學院農業(yè)部都市農業(yè)（北方）重點實驗室開放課題（KFK-2015001）

田 晶（1987-），女，山西浮山人，講師，博士，主要從事昆蟲病理與生物防治研究。E-mail：15835898286@126.com

*通訊作者：馬瑞燕（1968-），女，山西太谷人，教授，主要從事生物防治研究。E-mail：maruiyan2004@163.com