王 璟，張家慶，白獻曉，高彬文，陳俊峰，張 彬，郭紫林，王華帥，邢寶松*

（1.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南興銳農牧科技有限公司，河南信陽465550）

葡萄糖對后備母豬繁殖相關基因表達的影響

王 璟1，張家慶1，白獻曉1，高彬文1，陳俊峰1，張 彬1，郭紫林1，王華帥2，邢寶松1*

（1.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南興銳農牧科技有限公司，河南信陽465550）

為探討用葡萄糖代替鉻制劑調控母豬繁殖性能的可行性，將6頭70～80 kg大約克后備母豬隨機分為對照組和試驗組，對照組飼喂基礎日糧，試驗組在基礎日糧中添加200 g/d劑量的葡萄糖，試驗時間為21 d，采用ELISA方法測定血清中胰島素、孕激素和雌激素分泌量，實時定量PCR檢測繁殖相關基因表達量。結果表明，添加葡萄糖后，后備母豬血清中胰島素、孕激素和雌激素分泌量顯著增加，豬子宮中雌激素受體（ESR）、骨橋蛋白（OPN）、KISS1受體（GPR54）、孕激素受體（PGR）和視黃醇結合蛋白4（RBP4）等繁殖相關基因表達量均顯著上調。以上結果提示，可以使用葡萄糖代替鉻制劑，通過刺激胰島素的分泌達到提高后備母豬繁殖性能的目的。

后備母豬；胰島素；繁殖性狀；基因表達；葡萄糖

后備母豬是指從出生到發(fā)情生理階段的母豬，該階段母豬對養(yǎng)殖業(yè)具有非常重要的作用，其繁殖性能直接關乎養(yǎng)殖場的發(fā)展和經濟效益。近些年，我國后備母豬面臨發(fā)情率低、配種率低等問題，高淘汰率和低繁殖性能消耗大量的人力、物力、財力，嚴重威脅生豬產業(yè)的健康發(fā)展［1-2］，提高后備母豬的繁殖性能成為目前育種工作者研究的熱點。

胰島素對母豬的繁殖性能有很大影響，日糧能量等能夠通過胰島素經早期生長應答基因-1（Egr-1）、胞外信號調節(jié)激酶（ERK）和神經肽Y（NPY）等途徑作用于垂體，提高促性腺激素釋放激素（GnRH）、促黃體素（LH）和卵泡刺激素（FSH）等的分泌，這些激素作用于卵巢，促進雌激素（E2）和孕激素（P）的合成與釋放，進而促進卵泡發(fā)育，對母畜的發(fā)情、受孕、胚胎發(fā)育、仔畜初生質量、斷奶質量等繁殖性狀具有重要影響［3-4］。研究表明，胰島素分泌不足而患有糖尿病的后備母豬，其卵泡閉鎖率較高［5］。在初情期前，外源胰島素處理能夠減少小母豬的卵泡閉鎖率［6］。劉巖等［7］使用不同質量濃度胰島素刺激豬的顆粒細胞，隨著胰島素質量濃度增加，顆粒細胞的數(shù)目及其分泌的雌激素量明顯升高，當胰島素的質量濃度達到10 ng/m L時，顆粒細胞分泌雌激素的質量濃度達到最大。由此可見，胰島素對于母豬的卵泡發(fā)育具有重要作用。

研究證實，鉻能夠通過提高母豬機體對胰島素的敏感性影響其繁殖性能，在生產中通過給初產母豬補飼鉻調節(jié)其繁殖性能，如吡啶羧酸鉻［8］、煙酸鉻［9］、蛋氨酸鉻［10］、皮革蛋白粉［11］等。然而，鉻作為重金屬元素，會促進血液中部分蛋白質沉淀，引發(fā)貧血、腎炎、神經炎、呼吸道炎癥等疾病，長期接觸甚至誘發(fā)肺癌等。因此，尋找其他物質代替鉻元素促進母豬胰島素的分泌是亟需解決的問題。大量研究表明，葡萄糖是參與調控胰島β細胞合成分泌胰島素最為重要的調節(jié)物質，一方面葡萄糖從轉錄、轉錄后以及翻譯3個水平促進胰島素基因的表達量，此外葡萄糖通過第二信使途徑等誘導胰島β細胞分泌胰島素［12-14］。與鉻相比，葡萄糖既安全又易獲取，但能否將其作為鉻的替代物來調控母豬繁殖性能的研究尚未見報道。為此，本研究通過在飼料中添加葡萄糖誘導母豬胰島素分泌，檢測其血清繁殖相關激素含量的變化，同時通過實時定量PCR技術檢測其繁殖相關基因表達量的變化，驗證葡萄糖對胰島素的誘導作用以及葡萄糖通過胰島素對母豬繁殖性狀的影響。

1 材料和方法

1.1 供試動物及樣品采集

選取6頭70～80 kg大約克后備母豬（河南農科種豬科技有限公司），每頭豬具有同樣的遺傳背景。將6頭豬隨機分為2組，其中一組為試驗組，飼料中添加200 g/d劑量的葡萄糖［15］，每天3次，促進其體內胰島素的分泌。另一組作為對照組。所有供試豬嚴格按照商品豬的飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)。飼喂3周后進行屠宰試驗，屠宰前停飼24 h。屠宰前抽取每頭豬20m L靜脈血，4℃、3 000 r/min離心15 min，分離得到的血清立即凍于液氮中待測激素含量。屠宰后30 min內采集每頭豬的子宮組織，樣品剪成黃豆大小，立即凍存于液氮中待測其繁殖相關基因表達量。

1.2 試劑

葡萄糖以及實時定量PCR所用引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；胰島素、雌激素、孕激素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所有限公司；TRIZOL試劑和PrimeScriptTMRTPCR試劑盒購自英杰生命技術有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 儀器設備

冷凍離心機和PCR儀購自艾本德股份公司；紫外分光光度計購自Implen公司；實時定量PCR儀購自羅氏公司。

1.4 激素水平測定

按照試劑盒說明書使用酶聯(lián)免疫分析血清中的胰島素、雌激素和孕酮含量。

1.5 總RNA的提取及cDNA的合成

使用TRIZOL試劑提取子宮組織的總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質量，然后使用紫外分光光度計檢測所提RNA的濃度。稀釋為同一濃度后，使用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒合成cDNA。

1.6 實時定量PCR檢測繁殖相關基因表達變化

根據GenBank數(shù)據庫的相關基因信息，使用Primer Premier 5.0軟件設計實時定量分析的引物，包括雌激素受體（estrogen receptor 1，ESR）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、視黃醇結合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）、黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）、孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、KISS1受體（KISS1 receptor，GPR54）等6個繁殖性狀相關的基因，具體引物信息見表1。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行定量PCR分析。擴增體系包含cDNA 2μg，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，2×SYBR Ex TaqⅡ12.5 μL。擴增程序為：94℃3 m in；95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS統(tǒng)計分析軟件完成激素和基因表達差異的顯著性檢測，結果用平均值±標準誤來表示。

2 結果與分析

2.1 添加葡萄糖對相關激素的影響

添加葡萄糖極顯著改變胰島素、雌激素和孕酮的表達量（表2）。與對照組相比，試驗組胰島素上調了4.76倍，孕酮表達量變化最大，上調了4.93倍，雌激素上調倍數(shù)最低，為1.74倍。

2.2 添加葡萄糖對繁殖相關基因表達量的影響

添加葡萄糖對所選的6個繁殖相關基因的表達量均有影響，與對照組相比，僅LHR基因表達量下調（試驗組和對照組差異不顯著），ESR、OPN、GPR54、PGR和RBP4基因表達量均上調。其中，ESR表達量變化最大，添加葡萄糖其表達量上調5.056倍（P＜0.01），RBP4基因上調倍數(shù)最少，上調2.108倍（P＜0.05）（圖1）。

ESR基因存在于母豬子宮、陰道等多種靶組織中，對其雌激素發(fā)揮作用具有關鍵作用［16］。ESR對母豬繁殖周期的維持以及繁殖力的調控起重要作用，是調控母豬產仔數(shù)的主效基因［17］。通過PCRRFLP分析，ESR基因對我國地方品種母豬產仔數(shù)均有極顯著影響，不同基因型母豬每胎產仔數(shù)差異1.40～3.37頭，而每胎產活仔數(shù)差異0.63～3.58頭［18］。本研究中，添加葡萄糖后，后備母豬血清中胰島素和雌激素含量極顯著升高（P＜0.01），其子宮ESR基因表達量也極顯著升高（P＜0.01），提示添加葡萄糖可以通過促進胰島素的分泌調控后備母豬的繁殖性能。

OPN編碼一種細胞外基質蛋白，即骨橋蛋白，是子宮分泌的非常重要的蛋白質。骨橋蛋白能夠增強細胞之間的粘合和信號傳遞，其在胚胎著床、胎盤形成以及維持妊娠方面起著關鍵作用［19］。豬OPN基因表達量隨著妊娠期過程增加，在妊娠期85 d其表達量最高，其表達量與孕激素對豬子宮內膜的調控規(guī)律一致，提示其表達量受孕激素的調控［20-21］。研究表明，向大白豬子宮內膜上皮細胞添加不同濃度的雌激素和孕激素，發(fā)現(xiàn)雌激素對OPN具有明顯的抑制作用，而孕激素明顯促進OPN的表達，因為OPN基因上游調控區(qū)包含孕激素調控元件（PRE）［22］。本研究中，在后備母豬飼料中添加葡萄糖后，其雌激素和孕激素表達量均顯著上調，但是孕激素的上調幅度（4.90倍）高于雌激素的上調幅度（1.74倍），所以孕激素對OPN的促進作用比雌激素對OPN的抑制效果更明顯，實時定量PCR結果與此結果相符，添加葡萄糖后OPN基因表達量極顯著增高。

在豬、牛等動物整個發(fā)情期子宮內都有LHR的表達，其表達量在黃體期最高［23］。研究表明，LHR mRNA在濟寧青山羊整個發(fā)情周期的子宮中都有表達，在發(fā)情期表達量最低，在間情期逐漸升到最高值［24］。本研究中，后備母豬飼料中添加葡萄糖對其子宮LHR基因表達影響并不顯著，可能與選取的子宮組織有關，下一步可檢測該基因在卵巢表達量的變化。

基于本研究結果，可以用葡萄糖代替各種鉻制劑刺激后備母豬胰島素上調，促進其繁殖相關激素分泌及基因表達，影響后備母豬的卵泡發(fā)育、發(fā)情等性狀。葡萄糖對動物和人沒有直接危害，可以避免鉻制劑帶來的重金屬污染，下一步試驗需要精確驗證葡萄糖的添加時間及劑量，將成本降低到最小。

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Effects of Glucose on the Expression of Genes Related to Reproduction in Replacement Gilts

WANG Jing1，ZHANG Jiaqing1，BAIXianxiao1，GAO Binwen1，CHEN Junfeng1，ZHANG Bin1，GUO Zilin1，WANG Huashuai2，XING Baosong1*
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.Henan Xing Rui Agricultural and Animal Husbandry Technology Co.，Ltd，Xinyang 465550，China）

In order to investigate the feasibility of regulating the reproductive performance of the replacement gilts with glucose instead of chromium，six 70—80 kg Yorkshire replacement gilts were random ly allocated to experimental group and control group.During the 21-day research，glucose was addded to the meal diets of the experimental groups（200 g/d）.It was found that the addition of glucose significantly promoted the serum insulin，progesterone and estrogen by ELISA analysis.And qRT-PCR showed that the expression of the estrogen receptor 1（ESR），osteopontin（OPN），KISS1 receptor（GPR54），progesterone receptor（PGR），retinol binding protein 4（RBP4）were significantly up-regulated by the adding of glucose.These results suggested thatwe could use glucose instead of chromium to stimulatethe insulin secretion，and to achieve the purpose of improving reproductive performance of rep lacement gilts.

rep lacement gilts；insulin；reproductive traits；gene expression；glucose

Q78；S828

A

1004-3268（2017）01-0140-04

2016-07-10

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目（162300410143）；河南省農業(yè)科學院自主創(chuàng)新基金項目（2015ZZ34）作者簡介：王 璟（1985-），女，陜西潼關人，助理研究員，博士，主要從事動物遺傳育種研究工作。E-mail：wangjing-0407@163.com

*通訊作者：邢寶松（1969-），男，河南新密人，副研究員，博士，主要從事豬的育種與管理研究工作。