李旭光，周剛，周軍，林海，李躍華，陸全平，付龍龍，張?jiān)瀑F

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

水生甲殼類幾丁質(zhì)酶類基因家族功能與表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

李旭光，周剛，周軍，林海，李躍華，陸全平，付龍龍，張?jiān)瀑F

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

水生甲殼類幾丁質(zhì)酶類是分解幾丁質(zhì)外骨骼，消化幾丁質(zhì)類食物的關(guān)鍵酶類，在水生甲殼類的蛻皮生長與營養(yǎng)代謝過程中起著重要作用。文章重點(diǎn)從水生甲殼類幾丁質(zhì)酶類基因的結(jié)構(gòu)特征、時(shí)空分布、功能作用、內(nèi)源與外源調(diào)控等方面進(jìn)行概述。

水生甲殼類；幾丁質(zhì)酶基因；表達(dá)調(diào)控

幾丁質(zhì)又稱甲殼素，是僅次于纖維素的第二大天然多糖，廣泛存在于細(xì)菌、昆蟲和甲殼類動物之中，也是甲殼類外骨骼的主要組成成分。幾丁質(zhì)的降解與合成是甲殼類順利完成蛻皮，進(jìn)行生長發(fā)育的重要生理過程[1-2]。幾丁質(zhì)酶系廣泛存在于微生物、植物、昆蟲以及甲殼類動物等體內(nèi)。根據(jù)氨基酸序列的同源性幾丁質(zhì)酶系分為18和19兩個(gè)家族[3]。18家族廣泛存在于微生物、昆蟲、甲殼類和哺乳動物中，而19家族多存在于植物中，廣泛分布于植物莖、葉、種子及愈傷組織中的幾丁質(zhì)酶類在受到外界因素刺激如病原侵染后植物體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶類的活性迅速增強(qiáng)，表明幾丁質(zhì)酶類具有保衛(wèi)植物體的重要功能。而在哺乳動物（人類）體內(nèi)表達(dá)的幾丁質(zhì)酶類主要參與T細(xì)胞調(diào)控的免疫應(yīng)答調(diào)控以及過敏反應(yīng)等重要的生理過程，其中一些不含有谷氨酸催化保守區(qū)域GH18家族蛋白可能還具有凝集素的功能作用[4]。

在昆蟲和甲殼類動物體內(nèi)，幾丁質(zhì)酶系是水解外骨骼幾丁質(zhì)的關(guān)鍵酶類，與機(jī)體的蛻皮生長、變態(tài)發(fā)育、營養(yǎng)代謝、免疫病害防御等重要生理功能密切相關(guān)，對應(yīng)的幾丁質(zhì)酶基因也是一個(gè)多基因家族[5-6]。昆蟲生長發(fā)育過程中要周期性的蛻去舊表皮和換掉圍食膜主要依賴于昆蟲體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶基因家族。目前已在赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、東亞飛蝗（Locusta migratoria）發(fā)現(xiàn)23、17、16和7個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，歸屬8個(gè)不同組類基因家族[7-10]。其中一些幾丁質(zhì)酶在蛻皮液發(fā)現(xiàn)，涉及到外骨骼的分解代謝以及蛻皮周期過程；一些腸道中發(fā)現(xiàn)，與幾丁質(zhì)食物的營養(yǎng)消化有關(guān)；一些幾丁質(zhì)酶涉及變態(tài)發(fā)育過程中的腹部收起與鞘翅展開。昆蟲幾丁質(zhì)酶基因家族多樣化可能與幾丁質(zhì)的不同類型以及不同形態(tài)結(jié)構(gòu)需要不同的幾丁質(zhì)酶催化作用有關(guān)[11]。與昆蟲等其他生物幾丁質(zhì)酶系的基因家族調(diào)控與病害防控應(yīng)用相比，甲殼類幾丁質(zhì)酶尚處于單個(gè)或多個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的克隆發(fā)現(xiàn)與功能分析水平，研究尚屬薄弱，主要集中在組織特異性表達(dá)、蛻皮周期變化規(guī)律、內(nèi)源性激素調(diào)控、外源性污染物干預(yù)影響以及免疫防控等方面[12-14]。

1 水生甲殼類幾丁質(zhì)酶基因的結(jié)構(gòu)特征

Watanabe等[15]首次在甲殼類動物日本囊對蝦（Marsupenaeus Japonicus）的肝胰臟組織中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶基因Pjchi-1，從而開啟了研究水生甲殼類幾丁質(zhì)酶基因家族的序幕，此后陸續(xù)在其他蝦蟹類動物發(fā)現(xiàn)多個(gè)幾丁質(zhì)酶基因。隨著重要甲殼類模式生物轉(zhuǎn)錄組與基因組的測序完成，甲殼類幾丁質(zhì)酶基因家族的幾丁質(zhì)酶基因的發(fā)現(xiàn)越來越多。目前在水生甲殼類中發(fā)現(xiàn)的三十幾種幾丁質(zhì)酶類基因，主要集中在具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的十足目蝦蟹類中[16-22]，包括長尾派類的凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊對蝦（Marsupenaeus Japonicus）、日本仿長額蝦（Pandalopsis japonica）和短尾派類鋸緣青蟹（Scylla serrata）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）等。

對已分離獲得的水生甲殼類幾丁質(zhì)酶基因蛋白的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，水生甲殼類幾丁質(zhì)酶是一個(gè)多基因家族，具有典型的18家族幾丁質(zhì)酶特征，一般包括N端的活性催化區(qū)、C端富含半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)以及連接這兩個(gè)區(qū)域、富含脯氨酸、谷氨酸的連接區(qū)。水生甲殼類同一幾丁質(zhì)酶基因家族中的不同幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)也有所不同。在同一水生甲殼類動物體內(nèi)一些在外表皮組織幾丁質(zhì)酶類具有完整的催化區(qū)、結(jié)合區(qū)和連接區(qū)，主要涉及到外骨骼的分解代謝；而一些在肝胰臟組織幾丁質(zhì)酶類僅具有催化區(qū)，缺少幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)與連接區(qū)，主要涉及幾丁質(zhì)類食物的消化分解。缺少幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)的幾丁質(zhì)酶類仍舊具有分解幾丁質(zhì)的能力，但是由于缺少幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)與底物的結(jié)合，其分解幾丁質(zhì)的活性要低于具有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)的幾丁質(zhì)酶類。

2 水生甲殼類幾丁質(zhì)酶基因的組織分布

甲殼類幾丁質(zhì)酶基因家族中的幾丁質(zhì)酶基因在不同組織中的分布表達(dá)具有明顯的組織特異性，其中一些幾丁質(zhì)酶基因僅在某一組織中被檢測到，而另一些幾丁質(zhì)基因在多個(gè)組織中被發(fā)現(xiàn)。Huang等[16]在研究南美白對蝦幾丁質(zhì)酶基因的組織表達(dá)發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶基因LvChi-5和LvChiD1在肝胰臟、腸、外表皮、鰓、眼柄、心臟、肌肉、血細(xì)胞組織均能檢測到，LvChi-6主要在外表皮、鰓和眼柄組織中表達(dá)，LvChi-1、LvChi-3和LvChi-4僅在肝胰臟組織表達(dá)，LvChi-2主要在眼柄組織中表達(dá)。Proespraiwong等[17]報(bào)道了斑節(jié)對蝦幾丁質(zhì)酶基因PmChi-1和PmChi-3主要在肝胰臟組織表達(dá)，而PmChi-2主要在外表皮組織表達(dá)。Salma等[19]報(bào)道了日本仿長額蝦幾丁質(zhì)酶基因PjChi-1，PjChi-3A、PjChi-3B、PjChi-3C和PjChi-4主要在肝胰臟和腸組織表達(dá)，而PjChi-2主要在外表皮組織表達(dá)。在蟹類方面，鋸緣青蟹幾丁質(zhì)酶基因SsChi-1和SsChi-4在肝胰臟和鰓組織中均高表達(dá)，SsChi-3僅在肝胰臟組織中專一表達(dá)，SsChi-2在鰓組織和外表皮組織中表達(dá)。肝胰臟與外表皮組織是甲殼類幾丁質(zhì)酶高表達(dá)的重要組織，進(jìn)一步研究表明肝胰臟、腸組織表達(dá)的幾丁質(zhì)酶可能主要與降解含幾丁質(zhì)類食物及營養(yǎng)吸收有關(guān)，而在外表皮組織表達(dá)的幾丁質(zhì)酶基因主要與外骨骼生理性周期蛻皮密切相關(guān)。

3 水生甲殼類幾丁質(zhì)酶基因在蛻皮周期過程的表達(dá)規(guī)律

甲殼類幾丁質(zhì)酶基因在周期性生理蛻皮過程的表達(dá)變化顯著。Watanabe等[23]首次在蝦類中發(fā)現(xiàn)在外表皮組織特異性表達(dá)的幾丁質(zhì)酶基因PjChi-2在日本囊對蝦蛻皮前期顯著增大，而蛻皮間期表達(dá)水平顯著降低。而Zou等[24]也在蟹類中報(bào)道了分布于外表皮與肝胰臟組織的幾丁質(zhì)酶活性在蛻皮前期（D1-4）的表達(dá)豐度顯著高于蛻皮后期（A/B）、蛻皮間期（C）的表達(dá)水平。水生甲殼類幾丁質(zhì)代謝酶基因的表達(dá)豐度與血液組織中的蛻皮激素濃度的變化趨勢具有一致性。在蛻皮間期（C）蛻皮激素濃度與幾丁質(zhì)酶類活性處于基線水平，當(dāng)進(jìn)入蛻皮前期（D0），蛻皮激素濃度與幾丁質(zhì)酶活性開始升高，到蛻皮前期（D1-2）達(dá)到峰值，進(jìn)入蛻皮前期（D3-4）蛻皮激素含量和幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到最高值，到蛻皮后期（A-B）蛻皮激素濃度與幾丁質(zhì)酶活性又降回到正常水平[25]。然而也有一些報(bào)道甲殼類代謝酶基因在蛻皮周期過程的表達(dá)趨勢與血液中的蛻皮激素濃度變化相反。Rocha等[14]在研究南美白對蝦幾丁質(zhì)酶基因LvChi-2在蛻皮周期的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶基因LvChi-2在蛻皮間期到蛻皮前期過程中其表達(dá)豐度提高了15倍，而到達(dá)蛻皮前期（D1-3）期間幾丁質(zhì)酶表達(dá)水平在基線附近，這與之前甲殼類幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)趨勢有所不同。

4 水生甲殼類幾丁質(zhì)酶類的生物學(xué)功能

近年來利用RNA干擾技術(shù)使靶基因沉默成為直接研究幾丁質(zhì)酶基因在蛻皮周期過程功能作用的重要手段[11]。通過向不同生長發(fā)育階段的Tribolium castaneum注射dsRNA直接導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶類基因的表達(dá)沉默，當(dāng)幾丁質(zhì)酶TcCHT10表達(dá)沉默后，T.castaneum在幼蟲、蛹以及成蟲階段均無法正常完成蛻皮過程而死亡，表明幾丁質(zhì)酶基因Tc－CHT10是幼蟲、蛹階段蛻皮以及成蟲蛻皮生長過程中所必需的功能基因。而當(dāng)注射dsRNA下調(diào)Tc－CHT5表達(dá)時(shí)，T.castaneum雖然都能夠順利完成幼體、蛹階段的蛻皮生長過程，但最終都在蛹向成蟲的變態(tài)發(fā)育5～6 d后死亡，表明幾丁質(zhì)酶基因Tc－CHT5是T.castaneum從蛹階段向成蟲階段變態(tài)蛻皮的關(guān)鍵酶類。李大琪等[10]利用RNAi干擾技術(shù)直接抑制外表皮組織中幾丁質(zhì)酶基因LmCht6表達(dá)，通過向機(jī)體內(nèi)注射dsRNA下調(diào)LmCht6后發(fā)現(xiàn)，東亞飛蝗蛻皮過程中新表皮與舊表皮無法正常完全分離而最終導(dǎo)致死亡。這些研究進(jìn)一步證明了幾丁質(zhì)酶基因在其蛻皮周期過程中起著關(guān)鍵性作用，當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)受到抑制沉默后，生物體無法有效降解舊骨骼順利完成蛻皮發(fā)育過程，而導(dǎo)致其死亡。

5 內(nèi)源性激素對水生甲殼類幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)調(diào)控

幾丁質(zhì)酶類是甲殼類體內(nèi)多種激素通過信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控完成生理性周期蛻皮過程的終端產(chǎn)物，與激素的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[26-27]。通過對上游端蛻皮類激素的信號通路的調(diào)控干預(yù)將會影響到下游幾丁質(zhì)代謝酶類基因的表達(dá)以及酶活性。當(dāng)前已開展了蛻皮激素、蛻皮抑制激素、蛻皮激素受體等上游激素對幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)及酶活性影響的研究。蛻皮激素是最早被發(fā)現(xiàn)對幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)具有調(diào)控作用的激素。在甲殼類體內(nèi)幾丁質(zhì)代謝酶基因的表達(dá)豐度及酶活性變化趨勢與蛻皮激素含量變化規(guī)律存在一致性；而通過向甲殼類體內(nèi)注射蛻皮激素能夠引起機(jī)體外表皮和腸組織中的幾丁質(zhì)代謝酶基因的表達(dá)豐度顯著升高，幾丁質(zhì)酶活性增強(qiáng)[28，20]。蛻皮激素受體和維甲酸受體是位于甲殼類蛻皮周期過程中信號通路級調(diào)控的上游端，亦是參與調(diào)控幾丁質(zhì)酶基因的關(guān)鍵基因。Priya等[13]開展了中國對蝦蛻皮激素受體對幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的調(diào)控研究，當(dāng)向蝦體內(nèi)注射dsRNA后，幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)也顯著下調(diào)，表明蛻皮激素受體基因參與激素調(diào)控級聯(lián)放大反應(yīng)，對幾丁質(zhì)酶的表達(dá)具有明顯的調(diào)控作用。蛻皮抑制激素是屬于甲殼類高血糖激素家族神經(jīng)肽，主要由位于眼柄X-器官分泌。Pamuru等[29]通過切除眼柄、注射蛻皮抑制激素dsRNA和注射蛻皮激素三種方法分析對紅螯龍蝦（Cherax quadricarinatus）幾丁質(zhì)酶基因的影響，其中切除眼柄比注射MIH dsRNA和注射蛻皮激素更能有效激活幾丁質(zhì)代謝酶類分解幾丁質(zhì)，縮短甲殼類蛻皮周期時(shí)間。而對于蛻皮抑制激素濃度變化對不同組織幾丁質(zhì)酶基因的促進(jìn)或抑制作用具體機(jī)制還不清楚。

6 外源性環(huán)境污染物對水生甲殼類幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)影響

隨著工農(nóng)業(yè)與漁業(yè)的發(fā)展，水生環(huán)境受到越來越多的環(huán)境污染物污染，許多環(huán)境污染物通過食物鏈的傳遞與濃縮作用，在水生甲殼類體內(nèi)迅速蓄積放大，干擾水生甲殼類的內(nèi)分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而影響正常的蛻皮發(fā)育過程，甚至導(dǎo)致其死亡。環(huán)境污染物通過影響甲殼類內(nèi)蛻皮激素的合成和釋放或競爭Y器官蛻皮激素受體等方式，干擾蛻皮激素-蛋白調(diào)控信號網(wǎng)絡(luò)，抑制水解蛋白酶特別是幾丁質(zhì)酶類活性，延長了蛻皮周期時(shí)間，影響正常蛻皮發(fā)生，導(dǎo)致甲殼類無法順利完成蛻皮死亡。甲殼類外表皮組織中的幾丁質(zhì)酶類是蛻皮調(diào)控表達(dá)的終端，通過測定外表皮組織的幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)變化反應(yīng)其受污染的影響程度。據(jù)報(bào)道暴露在多氯聯(lián)苯、有機(jī)氯農(nóng)藥、己烯雌酚、硫丹等環(huán)境污染物條件下，招潮蟹外表皮組織的幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)以及酶活性均受到顯著抑制[30]。當(dāng)褐對蝦（Penaeus aztecus）受到多環(huán)芳香烴類的環(huán)境污染物影響時(shí)，位于外表皮組織中的幾丁質(zhì)酶基因NAG mRNA的表達(dá)豐度也受到顯著影響[31]。一些內(nèi)分泌干擾素如與雌激素受體結(jié)合的聚氯酮、甲氧氯等殺蟲滅菌類藥物的使用亦會引起幾丁質(zhì)酶表達(dá)活性的下調(diào)，進(jìn)而影響甲殼類的蛻皮過程。

當(dāng)水生甲殼類受到外源性刺激如病害侵染時(shí)，機(jī)體幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)豐度發(fā)生顯著變化，表明幾丁質(zhì)酶基因可能直接參與生物體的免疫防控。Zhang[18]報(bào)道了日本對蝦在受到白斑病毒（WSSV）侵染后幾丁質(zhì)酶基因Pjchi-3表達(dá)豐度上調(diào)，可能與機(jī)體免疫抵抗有關(guān)。在中國明對蝦肝胰臟組織發(fā)現(xiàn)與Pjchi-3直系同源基因Fcchi-3在受到對蝦白斑病毒侵染后mRNA豐度升高，表明幾丁質(zhì)酶基因Pjchi-3與Fcchi-3可能在對蝦防御抵抗病毒過程中起著重要作用。在其他一些水生動物如南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）、日本七鰓鰻（Lampetra japonica）、長牡蠣（Crassostrea gigas）也報(bào)道幾丁質(zhì)酶基因參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)過程[32]。

7 展望

幾丁質(zhì)代謝酶基因在節(jié)肢動物蛻皮生長中的功能作用是近年研究的熱點(diǎn)。當(dāng)前昆蟲幾丁質(zhì)酶類研究已經(jīng)在幾丁質(zhì)酶基因的克隆定位、蛻皮周期的變化規(guī)律、RNA干擾功能研究、內(nèi)源激素調(diào)控、環(huán)境污染物影響、異源表達(dá)及病害防控等方面作了較為深入的研究。而水生甲殼類幾丁質(zhì)代謝酶基因的研究尚屬起步階段，至今沒有形成有較為系統(tǒng)的研究，今后仍然需要加強(qiáng)對重要經(jīng)濟(jì)蝦蟹類的幾丁質(zhì)酶類基因家族的開發(fā)，重點(diǎn)關(guān)注甲殼類內(nèi)分泌調(diào)控激素（蛻皮激素、蛻皮抑制激素、蛻皮激素受體等）對下游端終端產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶類的調(diào)控機(jī)制，外源性環(huán)境污染物對甲殼類幾丁質(zhì)酶基因家族的干預(yù)抑制路徑及污染程度分析，幾丁質(zhì)酶體外異源高效表達(dá)以及在甲殼類養(yǎng)殖生產(chǎn)中的同步化蛻皮生長應(yīng)用等方面研究。

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[32]Chongsatja，Phattara-orn，Bourchookarn A，et al.Proteomic analysis of differentially expressed proteins inPenaeus vannameihemocytes upon Taura syndrome virus infection[J]. Proteomics，2007（7）：3592-3601.

Research progresses in function and expression regulation of chitinase gene family of aquatic crustaceans

Li Xuguang，Zhou Gang，Zhou Jun，Lin Hai，Li Yuehua，Lu Quanping，Zhang Yungui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Chitinases，a multi-gene family，are crucial enzymes involved in digestion of chitinous food and degradation of chitinous exoskeleton in aquatic crustaceans，which play important physiological roles in growth and the nutrition metabolism.In this paper，the structure of chitinases，tissue distribution，expression of the molting cycle，physiological function，endogenous and exogenous regulation and other aspects are reviewed.

Aquatic crustaceans；chitinase gene；expression regulation

S966.16

A

004-2091（2017）04-0026-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.006

2016-10-18）

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20161602）、江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新[CX（15）1011]、江蘇省水產(chǎn)三新工程（D2015-5、D2016-1）

李旭光（1981-），男，助理研究員，主要從事水生甲殼類研究.E-mail:xuguangli1981@163.com

周剛（1962-），男，研究員.E-mail:zhougang2003@hotmail.com