□ 張嘉薈 方志宇 喬文姝 中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測概況

□ 張嘉薈 方志宇 喬文姝 中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

本文總結(jié)了近幾年實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測中的應(yīng)用，并概述了這一技術(shù)的前景，以供參考。

金黃色葡萄球菌；檢測；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

近年來，食品安全事件頻發(fā)，其中食源性致病菌引起的案例數(shù)占有較大比例。世界各國食源性疾病的發(fā)生均呈上升趨勢(shì)，美國疾控制中心的一份報(bào)告顯示：在細(xì)菌性食物中毒的案例中，有近三分之一是由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的[1]。發(fā)展中國家情況更為嚴(yán)重。在這一背景下，探索一種快檢技術(shù)已成為當(dāng)下急需解決的問題。

現(xiàn)階段，主要使用酶聯(lián)免疫法、平板培養(yǎng)顯色法等方法對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測[2]。但以上方法的檢測結(jié)果沒有時(shí)效性，無法進(jìn)行動(dòng)態(tài)的結(jié)果分析，也不利于定量分析。目前，有一種在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，能夠在一定程度上解決這些難題，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[3]。這一方法改進(jìn)了常規(guī)的反應(yīng)法，能夠?qū)χ虏【那闆r進(jìn)行動(dòng)態(tài)且定量的檢測。該方法具有特異性強(qiáng)、假陽性低；靈敏度高、準(zhǔn)確性高；操作簡單、交叉污染機(jī)會(huì)少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測

金黃色葡萄球菌作為一種食源性致病菌，對(duì)人體的主要危害是由其產(chǎn)生的腸毒素造成的[4]。目前，為了能對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，人們已經(jīng)逐漸開始將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用到金黃色葡萄球菌的檢測中。

唐吉思等人[5]根據(jù)一種在牛乳中發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌的腸毒素中的基因（sea），建立了針對(duì)性的檢測方法，即sea DNA上的SYBR Green I基因的檢測方法。這種方法的最低可檢測限的陽性質(zhì)粒能夠達(dá)到49.5 fg/μL的精度要求，并且其檢測結(jié)果具有較好的相關(guān)性（R2=0.99）。

Hein等人[6]在比較SYBR Green I 染料法與TaqMan探針法反應(yīng)的靈敏度時(shí)，發(fā)現(xiàn) SYBR Green I 染料法單位體積的能夠達(dá)到的拷貝數(shù)是TaqMan探針法單位體積能夠達(dá)到的拷貝數(shù)的10倍。

Chen等人[7]針對(duì)ssaN基因上的一段特征序列設(shè)計(jì)了特異性引物。通過對(duì)臨床已知的沙門氏菌分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：該方法對(duì)腸炎沙門氏菌株的最低檢出限較鼠傷寒沙門氏菌株的低。

2 總結(jié)與展望

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為一種新技術(shù)，與傳統(tǒng)意義上的PCR技術(shù)相比，實(shí)現(xiàn)了定性到定量的突破，打破了傳統(tǒng)PCR技術(shù)只能在反應(yīng)的終點(diǎn)進(jìn)行檢測的局限，能夠有效避免污染以及定量不準(zhǔn)確等關(guān)鍵性問題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有很強(qiáng)的針對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性，同時(shí)還具備反應(yīng)效率高、反應(yīng)靈敏等優(yōu)勢(shì)。適用于大量樣品的檢測，具有廣泛的應(yīng)用前景。

近年來，在諸多學(xué)者的研究下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)得到了快速的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)條件更加準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性也得到了提高，這也為該技術(shù)向生產(chǎn)中推廣奠定了基礎(chǔ)。但依據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用也有一定的條件性，如在檢測腸炎沙門氏菌株中，運(yùn)用該方法的最低檢出限偏低。因此，在今后的科研工作中，應(yīng)該更多的探索該項(xiàng)技術(shù)的適用條件。參考文獻(xiàn)

[1]李一松,王明娜,呂琦,等.SYBR Green I熒光定量PCR檢測乳中攜帶sea基因金黃色葡萄球菌的研究[J].食品科學(xué),2008(7):235-239.

[2]Fernández-No IC, Guarddon M,B?hme K, et al. Detection and quantification of spoilage and pathogenic Bacillus cereus, Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis by real-time PCR.[J]. Food Microbiology, 2011, 28(3):605-610.

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[4]姜毓君,李一松,相麗,等.RTPCR檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A基因[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009(2):88-91.

[5]唐吉思,布日額,吳金花,等.熒光定量PCR檢測牛乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A基因方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012(1):56-59.

[6]Hein I, Lehner A, Rieck P, et al.Comparison of Different Approaches To QuantifyStaphylococcus aureus Cells by Real-Time Quantitative PCR and Application of This Technique for Examination of Cheese[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2001(7):3122-3126.

[7]Chen J, Zhang L, Paoli G C, et al.A real-time PCR method for the detection of Salmonella enterica from food using a target sequence identified by comparative genomic analysis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010(2-3):168-174.