楊移斌 艾曉輝 宋 懌

水產(chǎn)動(dòng)物病原藥物敏感性實(shí)驗(yàn)技術(shù)

楊移斌1，2艾曉輝1，2宋 懌2，1

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，高密度、集約化養(yǎng)殖雖然帶來(lái)了水產(chǎn)品產(chǎn)量的不斷攀升，但是同時(shí)也使得水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生存環(huán)境日漸惡化，從而導(dǎo)致各類(lèi)疾病頻發(fā)。病害發(fā)生導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失的原因常常是沒(méi)有做到準(zhǔn)確診斷，沒(méi)有做到對(duì)病用藥，通常是憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行診斷用藥。因此有必要提高水產(chǎn)一線從業(yè)者進(jìn)行病原分離，開(kāi)展藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的意識(shí)，以做到準(zhǔn)確診斷魚(yú)病，對(duì)病用藥。本文將就藥物敏感性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行介紹及改良，從而更好地供同行參考及應(yīng)用好藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。

1 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)使用范圍

藥物敏感性實(shí)驗(yàn)（簡(jiǎn)稱藥敏實(shí)驗(yàn)，）涉及到病原及藥物兩方面，因此病原必須是可體外培養(yǎng)的，可分離的，而藥物目前常用抗生素都有市售藥敏紙片供選擇，而針對(duì)其他藥物如消毒劑等，則可進(jìn)行相應(yīng)的MIC/MBC測(cè)定，從而評(píng)估病原對(duì)其敏感性。目前可以進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)的病原只有細(xì)菌、真菌以及一些寄生蟲(chóng)（寄生蟲(chóng)的藥敏實(shí)驗(yàn)主要以活蟲(chóng)體在藥物刺激下掙扎程度來(lái)反應(yīng)的）。

2 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)操作

目前藥敏實(shí)驗(yàn)主要分為瓊脂擴(kuò)散法（即K-B法）及倍比稀釋法，而瓊脂擴(kuò)散法又分為打孔法及藥敏紙片法。一般以藥敏紙片法及倍比稀釋法最常用。

無(wú)菌條件下，取患瀕死水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，取病灶及重要組織器官如肝腎脾等，用接種環(huán)蘸取所取各樣品在固體培養(yǎng)基上劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。從已經(jīng)長(zhǎng)好菌落的平板上挑取形態(tài)大小、顏色相近的菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)。向分離得到的純化菌株加入25%甘油，混勻后于-80℃冷凍保存。

藥敏紙片法：將分離株接種于液體培養(yǎng)基中，經(jīng)200r/min恒溫28℃震蕩培養(yǎng)18h，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整分離株濃度為104-108CFU/mL，取100μL菌液均勻涂布于固體瓊脂培養(yǎng)基上，貼上不同種類(lèi)的藥敏紙片，28℃恒溫培養(yǎng)24h后測(cè)量抑菌直徑，根據(jù)藥敏紙片說(shuō)明書(shū)或者其他標(biāo)準(zhǔn)判定分離株對(duì)不同藥物的敏感性。

倍比稀釋法：主要是通過(guò)使用液體培養(yǎng)基倍比稀釋藥物，然后在每個(gè)濃度藥物內(nèi)接種病原，恒溫培養(yǎng)24h后，把無(wú)菌生長(zhǎng)、稀釋度最大的藥物如消毒劑濃度作為分離株的MIC，取所有無(wú)菌生長(zhǎng)的組涂布于固體培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)24h后觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)，平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物如消毒劑濃度即為MBC。

3 實(shí)際生產(chǎn)中可選用的藥敏實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)際生產(chǎn)中由于條件限制以及病情的緊迫性，使得藥敏實(shí)驗(yàn)不太可能像在實(shí)驗(yàn)室這么開(kāi)展，因此制定生產(chǎn)中藥敏實(shí)驗(yàn)方法顯得更加迫切，下面就生產(chǎn)中可行的藥敏實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行詳細(xì)闡述。

首先針對(duì)發(fā)病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物進(jìn)行取樣，同樣是選擇具有典型癥狀瀕死的個(gè)體。在無(wú)菌條件下，取其病灶部位及重要組織器官。將所取樣品分別剪碎，溶解于無(wú)菌0.9%生理鹽水中，后涂布于固體平板上，或者接種含有不同濃度藥物試管中，其后操作同上，經(jīng)恒溫24h培養(yǎng)后即可讀取結(jié)果。

4 小結(jié)

本文就傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)意義、適用范圍及操作步驟進(jìn)行了相關(guān)闡述，可以使水產(chǎn)一線從業(yè)者更好地認(rèn)識(shí)及理解藥敏實(shí)驗(yàn)，也是為其重視、甚至是踐行藥敏實(shí)驗(yàn)提供良好的技術(shù)材料。對(duì)藥敏實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行改良的意義在于第一節(jié)省了寶貴的時(shí)間，直接把病樣碾碎，溶解于生理鹽水中，伴隨著把病原也溶于其中，從而不再需要純化培養(yǎng)細(xì)菌，可節(jié)省近三天的時(shí)間；第二在于提高了藥敏實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在現(xiàn)今各種病害頻發(fā)的年代，單一病原引發(fā)病害早已成為過(guò)去時(shí)，現(xiàn)在多是多種病原多重感染引發(fā)的，如黃顙魚(yú)腹水病、中華鱉腐皮病等，筆者從事水生動(dòng)物病害臨床診斷多年，深有感觸，好不容易將病樣中微生物純化分離出來(lái)，一看傻眼了，各種微生物呈現(xiàn)在眼前，而感染卻很少有成功的，多次重復(fù)都很難奏效，用此種病純化出來(lái)的微生物進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，其效果就可想而知了，本方法采用不純化病原，即使病原多樣，涂布于或者接種于液體培養(yǎng)基上，微生物都可生長(zhǎng)，而藥物對(duì)其抑制或者殺滅，都是同步反應(yīng)出來(lái)的，因此可以顯著提高藥敏實(shí)驗(yàn)效果。綜上，藥敏實(shí)驗(yàn)需好好做，但更應(yīng)該做好，為養(yǎng)殖戶謀福利，為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物減輕痛苦。

（通聯(lián)：1.430223，湖北省武漢市東湖高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)武大園1路8號(hào) 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所 電話：17771809619；2.1001412，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京）

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-49）資助