李逢振

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，湖南衡陽 421005）

蛋殼殘留蛋清中溶菌酶高效提取技術(shù)的研究

李逢振

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，湖南衡陽 421005）

蛋殼殘留蛋清占蛋殼質(zhì)量的27.6%～30.8%，蛋清中含有0.2%～0.4%的溶菌酶。通過一系列的分離提取工藝可從蛋清中獲取溶菌酶。溶菌酶是一種天然蛋白質(zhì)，對(duì)人體無毒害作用，且具有抑菌、消炎、抗病毒等功能，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥制劑、食品防腐和生物工程領(lǐng)域。對(duì)溶菌酶的性質(zhì)和應(yīng)用進(jìn)行了闡述，介紹了蛋清溶菌酶分離提取方法，為進(jìn)一步開發(fā)利用蛋清溶菌酶資源提供了科學(xué)依據(jù)。

蛋殼；蛋清；溶菌酶

0 引言

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種能水解致病菌的糖苷水解酶，其酶解主要作用于微生物細(xì)胞壁，而不影響其他組織。因此，也是一種安全無毒的蛋白質(zhì)。溶菌酶廣泛存在于鳥類和家禽的蛋清中，哺乳動(dòng)物的乳汁、唾液、血液、尿液、白細(xì)胞及其他體液和組織細(xì)胞內(nèi)，其中以鳥類和家禽蛋清中溶菌酶含量最為豐富，為0.2%～0.4%[1]。目前，市面上銷售的多數(shù)商品溶菌酶就是從蛋清中提取純化的。

我國(guó)是傳統(tǒng)的禽蛋生產(chǎn)大國(guó)，擁有極為豐富的禽蛋資源。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公布的統(tǒng)計(jì)資料數(shù)據(jù)顯示，2016年我國(guó)禽蛋產(chǎn)量已突破3 000×104t。蛋品加工企業(yè)和廣大消費(fèi)者在利用禽蛋的時(shí)候往往都只取用了蛋黃、蛋清等可食部分，而蛋殼則被當(dāng)作廢物扔棄，造成了環(huán)境污染，這些蛋殼中殘留了大量的蛋清，占蛋殼質(zhì)量的27.6%～30.8%[2]。由此可見，如果不對(duì)蛋殼及時(shí)處理，既嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境，又造成蛋清資源的浪費(fèi)。

1 溶菌酶的性質(zhì)與應(yīng)用

早在1907年，Nicolle發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌的溶液中存在一種未知的溶解子，這是人類第1次接觸溶菌酶這種物質(zhì)。1922年，F(xiàn)leming等人發(fā)現(xiàn)在人的眼淚、唾液中存在能夠溶解細(xì)菌細(xì)胞壁進(jìn)而殺死細(xì)菌的酶，并命名為溶菌酶。商品溶菌酶一般為白色或微白色粉末狀物質(zhì)，易溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI值為11.00～11.35，最適pH值為6.5。其在酸性介質(zhì)中可穩(wěn)定存在，而在堿性介質(zhì)中易失活。

溶菌酶能夠水解細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵[3]，因此可以溶解大多數(shù)革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁而具有溶菌作用，其對(duì)一些革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌和傷寒沙門氏菌）也具有較強(qiáng)的溶解作用。由此可見，溶菌酶的抗菌譜較廣。同時(shí)，溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì)，對(duì)人體無毒害作用，具有抑菌、消炎、抗病毒等功能，能在胃腸內(nèi)起到幫助消化、吸收的作用，并能提高機(jī)體免疫力，是一種安全性較高的食品保鮮劑、營(yíng)養(yǎng)保健品和抗菌消炎類藥品。同時(shí)，由于其在弱酸性環(huán)境下也能保持較強(qiáng)的活力，因此可作為防腐劑應(yīng)用于低酸食品中。另外，還是基因工程、細(xì)胞工程中細(xì)胞融合操作必不可少的工具酶[4]，用來提取微生物細(xì)胞內(nèi)各類物質(zhì)，以及進(jìn)行原生質(zhì)體制備及融合育種。

2 蛋殼殘留蛋清溶菌酶的提取方法

目前，國(guó)內(nèi)外從蛋殼殘留蛋清中提取溶菌酶時(shí)，將收集的蛋殼利用蛋殼處理機(jī)使蛋殼與殘留蛋清分離、過濾，然后采用直接結(jié)晶法、離子交換法、親和色譜法和超濾法等方法，從蛋清中分離提取溶菌酶。

2.1 直接結(jié)晶法

溶菌酶是一種較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，具有較強(qiáng)的耐熱、耐酸特性，在鹽溶液中也具有較好的穩(wěn)定性，通過改變環(huán)境pH值，可以使其以晶體形式析出，從而可以利用這一特性將溶菌酶與蛋清進(jìn)行分離。1945年Alderton G等人[5]提出采用直接結(jié)晶法制備溶菌酶，通過向蛋清中加入一定量的氯化物、碘化物或碳酸鹽等中性鹽，并使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至9.5～10.0，再逐步降低反應(yīng)體系溫度至4℃，放置2周時(shí)間，溶菌酶就會(huì)以結(jié)晶形式慢慢析出，而大多數(shù)蛋白質(zhì)仍然存留在溶液中，從而將溶菌酶從蛋清中分離出來。但是，采用直接結(jié)晶法分離出來的溶菌酶純度較低，因此需要采用重結(jié)晶的方法對(duì)分離出的溶菌酶初品進(jìn)行提純。采用直接結(jié)晶法分離提取溶菌酶具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、反應(yīng)條件溫和、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是目前以蛋清為原料分離提取溶菌酶的主要方法。

2.2 離子交換法

離子交換法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所發(fā)生的交換反應(yīng)進(jìn)行物質(zhì)分離的操作技術(shù)。2001年，李宗孝等人[6]采用724型樹脂提取雞蛋清溶菌酶，攪拌吸附后用1%的硫酸溶液洗脫，溶菌酶得率為0.14%。2002年，林親錄等人[7]采用732型樹脂純化溶菌酶，研究了不同pH值對(duì)溶菌酶提取效果的影響。2003年，宋宏新等人[8]采用724型樹脂提取溶菌酶，裝柱后抽提液緩慢流入柱中，先用緩沖液洗滌，再用硫酸銨洗脫，使得724型樹脂對(duì)溶菌酶的吸附率提高到83.5%。2007年，Bayramoglu G等人[9]用反相懸浮法制備了聚甲基丙烯酸接枝殼聚糖陽離子交換色譜填料來分離蛋清中的溶菌酶，并探索了樹脂吸附溶菌酶過程的動(dòng)力學(xué)模型，用HPLC測(cè)定洗脫液中溶菌酶的純度達(dá)到94%。采用離子交換法分離提取溶菌酶具有操作簡(jiǎn)便、高效、成本低和可自動(dòng)化連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，適用于溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 親和色譜法

20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的親和色譜技術(shù)是利用物質(zhì)的親和能力，將不溶性的載體與可逆結(jié)合的配體相偶聯(lián)，所制成的分離介質(zhì)具有特異親和性，能選擇性地吸附生物活性物質(zhì)，根據(jù)待分離物質(zhì)的特性，選擇相應(yīng)組成的溶液進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到分離提取所需物質(zhì)的目的。2001年，Vaidya A A等人[10]采用酸單體與N-異聚丙烯酰胺共聚物從蛋清中熱沉淀溶菌酶，收率達(dá)到90%。2007年，Lu A X等人[11]制備了一種新型的固定化Fe3+膠原纖維基質(zhì)吸附劑，用這種吸附劑對(duì)溶菌酶進(jìn)行吸附研究，得到溶菌酶純度達(dá)到100%。采用親和色譜法分離提取溶菌酶具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，能對(duì)蛋殼殘留蛋清中的溶菌酶進(jìn)行高效分離與純化。

2.4 超濾法

超濾法是通過控制超濾膜孔徑大小，在壓力的作用下將不同分子量的混合物溶液進(jìn)行分離，從而獲得目標(biāo)產(chǎn)物。超濾法是一種對(duì)新型的分離技術(shù)，其與傳統(tǒng)分離技術(shù)相比具有產(chǎn)品得率高、雜質(zhì)少、純度高等優(yōu)點(diǎn)。蛋清中含有卵白蛋白、卵鐵傳遞蛋白、卵黏蛋白、卵類黏蛋白和卵球蛋白等幾種主要蛋白質(zhì)，與其相比溶菌酶的分子量遠(yuǎn)小于上述蛋清中幾種主要蛋白質(zhì)的分子量，因此可用超濾法將溶菌酶從蛋清蛋白中分離出來。2000年，Ghosh R等人[12]采用小型中空纖維超濾系統(tǒng)從蛋清干粉中分離溶菌酶，溶菌酶選擇性透過膜，而其他大分子蛋白質(zhì)被膜所截留。

3 結(jié)語

溶菌酶是一種天然、安全無毒的蛋白質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。利用蛋殼中的殘留蛋清來分離提取溶菌酶，既解決了蛋殼中殘留蛋清污染環(huán)境的問題，又充分挖掘了殘留蛋清潛在的利用價(jià)值，有效降低了雞蛋溶菌酶的生產(chǎn)成本。上述幾種分離方法雖各具優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一些不足之處。因此，要不斷拓寬研究思路，優(yōu)化現(xiàn)有分離提取工藝，積極探索新的分離提取方法。

[1]左勝，吳佳歡，廖志勇.蛋清溶菌酶分離純化研究進(jìn)展 [J].科協(xié)論壇（下半月），2013（3）：73-74.

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[3]林翠花，肖素榮，孟慶國(guó).溶菌酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其應(yīng)用[J].濰坊學(xué)院學(xué)報(bào)，2005（2）：108-110.

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[6]李宗孝，原春蘭，張建超.蛋清中溶菌酶的提純研究[J].精細(xì)化工，2001，18（2）：103-105.

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[8]宋宏新，薛海燕，楊芳.雞蛋殼溶菌酶分離純化工藝研究 [J].食品工業(yè)科技，2003（9）：60-63.

[9]Bayramoglu G，Ekici G，Besirli N，et al.Preparation of ion-exchange beads on poly(methacylic acid）brush grafted chitosan beads：Isolation of lysozyme from egg white in batch system[J].Colloids and Surfaces A，2007（5）：68-77.

[10]Vaidya A A，Lele B S，Deshmukh M V，et al.Design and evaluation of new ligands for lysozyme recovery by affinity thermoprecipitation[J].Chemical Engineering Science，2001（7）：5 681-5 692.

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[12]Ghosh R，Silva S S，Cui Z F.Lysozyme separation by hollow-fiber ultrafiltration[J].Biochemical Engineering Journal，2000 （6）：19-24.◇

Study on the Efficient Extraction of Lysozyme from Egg White

LI Fengzhen
（College of Bioengineering，Hu'nan Environment Biological Polytechnic，Hengyang，Hu'nan 421005，China）

The residual eggshell quality accounts for 27.6%～30.8%of egg white，egg white lysozyme containing 0.2%～0.4%.The process can be obtained through separation of lysozyme from egg white lysozyme.A series of extraction is a kind of natural protein，it has no toxic effects on the human body，and has antibacterial，anti-inflammatory，anti viral and other functions，can be widely used in the field of pharmaceutical preparation the preservation of food and biological engineering.In this paper，the properties and applications of lysozyme were described，introduced the lysozyme extraction method provides a scientific basis for further development and utilization of lysozyme resources.

eggshell；egg white；lysozyme

Q956

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.043

1671-9646（2017） 12b-0057-02

2017-09-29

湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院院長(zhǎng)青年基金項(xiàng)目（Z2013-1）。

李逢振（1983— ），男，碩士，副教授，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工和畜禽廢棄物綜合利用。