□ 張新欣 長春市糧油衛(wèi)生檢驗監(jiān)測站

糧食中三種主要真菌毒素常用定量檢測技術(shù)概述

□ 張新欣 長春市糧油衛(wèi)生檢驗監(jiān)測站

真菌毒素是糧食產(chǎn)品的重要污染物之一，黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）是污染最為普遍的三種毒素。本文對糧食產(chǎn)品中這三種真菌毒素檢測技術(shù)研究進(jìn)行系統(tǒng)闡述，對以后的檢驗工作提供了一些的可借鑒經(jīng)驗。

真菌毒素；糧食；定量檢測技術(shù)；AFB1；ZEN；DON

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是糧食產(chǎn)品的主要污染源之一，對人類和動物都有嚴(yán)重危害。因此,對于霉菌毒素以及產(chǎn)毒霉菌的檢測顯得至關(guān)重要。黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）是污染最為普遍的三種毒素，在國家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2017中對各類糧食中的含量都有明確規(guī)定限量。

1 三種真菌毒素的危害[1-2]

黃曲霉毒素B1被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可誘發(fā)癌變。黃曲霉毒素B1能夠破環(huán)人和動物的肝臟組織，甚至引發(fā)肝癌和死亡。玉米赤霉烯酮有雌性激素的作用，可造成家禽和家畜的雌性激素水平提高，對動物的繁殖系統(tǒng)造成損傷，引發(fā)動物流產(chǎn)、死胎、畸胎甚至死亡等。急性中毒時，對心、腎、肝、肺和神經(jīng)系統(tǒng)有一定的毒害作用，可以使神經(jīng)系統(tǒng)亢奮，造成很多出血點，使動物突然死亡。嘔吐毒素能引起人和動物嘔吐、腹瀉、皮膚刺激、拒食、神經(jīng)紊亂、流產(chǎn)和死胎等，歐盟分類標(biāo)準(zhǔn)為三級致癌物。

2 三種真菌毒素的定量檢測方法

2.1 前處理技術(shù)[3]

2.1.1 提取

從糧食中提取AFB1、ZEN及DON，固體糧食樣品需要用粉碎機將其粉碎，過篩，再將樣品和提取液混合后于超聲波或渦旋振蕩器或搖床中超聲或振蕩20 min，或快速攪拌3 min，震蕩混勻后再過濾即可；液體樣品則需用有機溶劑或有機提取液溶解，震蕩混勻（方法同固體樣品）后，靜止或離心后過濾。

2.1.2 凈化

不同檢驗方法對提取液凈化程度要求不一，疫學(xué)方法特異性高，對樣品凈化程度要求相對較低，一般不需要復(fù)雜的凈化過程，而薄層色譜法（TLC）以及高效液相色譜法（HPLC）對樣品凈化程度要求較高，所得提取液需進(jìn)一步凈化和富集，可以通過液液分離、固相萃取和免疫親合柱等。一般玉米赤霉烯酮（ZEN）和嘔吐毒素（DON）經(jīng)過免疫親和柱的淋洗和洗脫后即可，而復(fù)雜樣品中的黃曲霉毒素B1（AFB1）經(jīng)過免疫親和柱后還需黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱（或功能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈┑倪M(jìn)一步凈化。

2.2 檢測

現(xiàn)在檢測三種真菌毒素的常用的定量分析方法有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）以及膠體金檢測技術(shù)。

2.2.1 薄層色譜法（TLC）[4-6]

薄層色譜法（TLC）是較早用來檢驗黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和嘔吐毒素（DON）的方法。樣品經(jīng)提取、濃縮和薄層分離后，在紫外光（波長365 nm）下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。薄層板上黃曲霉毒素B1的最低檢出量為0.0004 μg,檢出限為 5 μg/kg。薄層板上脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的最低檢出量為100 ng,檢出限為300 μg/kg。因TLC法優(yōu)點是適合于沒有經(jīng)過專門培訓(xùn)的人員操作，且成本低，無需價格昂貴的儀器，但目測半定量，檢驗結(jié)果易受主觀因素影響，現(xiàn)在使用先進(jìn)的熒光掃描技術(shù)進(jìn)行定量分析，克服了定性半定量的缺點，但此方法所需試劑繁多、檢測周期長、靈敏度偏低，使其應(yīng)用受到一定限制。

2.2.2 高效液相色譜法（HPLC）[7-9]

高效液相色譜法（HPLC）是定量分析真菌毒素最常用的方法。試樣中的嘔吐毒素（DON）經(jīng)提取凈化后,用高效液相色譜-紫外檢測器測定；試樣中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取凈化后，用高效液相色譜熒光檢測器測定；試樣中的黃曲霉毒素B1經(jīng)提取凈化后可采用柱前衍生-液相色譜分離-熒光檢測器檢測，也可采用液相色譜分離-柱后衍生-熒光檢測器檢測。柱后衍生方法包括碘或溴試劑衍生、光化學(xué)衍生和電化學(xué)衍生等。該法的高分離效能、高檢測效能、分析快速，為同時測定多種真菌毒素提供了條件。國標(biāo)中檢測谷物中三種真菌霉毒素檢測限分別為黃曲霉毒素B1（AFB1）0.3 μg/kg，玉米赤霉烯酮（ZEN）5 μg/ kg，嘔吐毒素（DON）100 μg/kg。此外高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，能夠大大提高分析的靈敏度和可靠性。但因設(shè)備昂貴、對樣品中毒素純度的要求較高，前處理復(fù)雜，導(dǎo)致檢測成本高、周期長，無法滿足大批量樣品快速篩選的需要。

2.2.3 酶聯(lián)免疫法（ELISA）[6,10]

酶聯(lián)免疫法（ELISA）屬于成熟的免疫學(xué)方法。試樣經(jīng)水提取、均質(zhì)、渦旋和離心（或過濾）等前處理后，試樣上清液或標(biāo)準(zhǔn)品中的真菌毒素與被酶標(biāo)記的酶連偶合物，競爭性結(jié)合微孔中預(yù)包被的特異性抗體，洗滌后加入相應(yīng)顯色劑顯色，經(jīng)無機酸終止反應(yīng),450 nm或630 nm波長下檢測，試樣中真菌毒素與吸光度在一定濃度范圍內(nèi)呈反比。酶聯(lián)免疫法（ELISA）具有靈敏、操作簡便、樣品前處理無需凈化和樣品處理量大等優(yōu)點，適用于對大批量糧食產(chǎn)品中三種真菌毒素的篩查。但是按照我國現(xiàn)在國標(biāo)規(guī)定，如果篩查結(jié)果為陽性，仍需用化學(xué)分析方法作進(jìn)一步確認(rèn)。

2.2.4 膠體金快速定量技術(shù)[10-11]

膠體金免疫層析技術(shù)是當(dāng)今最快、靈敏和方便的免疫學(xué)檢測技術(shù)之一，它將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上。當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上，與膠體標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，移至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。膠體金快速定量技術(shù)具有檢測時間短、靈敏度高、不用接觸毒素標(biāo)準(zhǔn)品、有機試劑用量少和對環(huán)境及檢驗人員安全性最高等優(yōu)點，適用于企業(yè)和質(zhì)檢機構(gòu)對糧油農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素進(jìn)行現(xiàn)場篩查。

3 結(jié)語

糧食中的污染物很多，真菌毒素是其中重要的一種，在合適的環(huán)境下，它將迅速產(chǎn)生并威脅人類和動物的健康。這就需要科學(xué)完善的限量標(biāo)準(zhǔn)和更加先進(jìn)的檢測技術(shù)。除了以上常用的定量方法外，還有氣相色譜、毛細(xì)管電泳和超臨界液相色譜技術(shù)等可用來檢測這三種真菌毒素，但由于各種原因在實際糧食檢驗中應(yīng)用甚少。相信隨著科研技術(shù)的發(fā)展,真菌毒素的檢驗方法會越來越多,越來越簡便。

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[3]郭衛(wèi).糧油食品中真菌毒素的研究進(jìn)展文[J].糧油加工,2010. (7):104-107.

[4]王照鵬 玉米赤霉烯酮檢測方法研究進(jìn)展[J]中國畜牧獸醫(yī)2009,(5):216-218.

[5]馬駿.ELISA和TLC檢測飼料中AFB1含量的比較研究[J].畜牧與飼料科2013.(2):19-23.

[6]鄭立新.淺談黃曲霉毒素B1測定中應(yīng)注意的問題[J].糧食加工,2004.(4):63-64.

[7] 國家衛(wèi)生委和計生委,食品中黃曲霉素B族和G族的測定(GB 5009.22-2016),北京:中國國家標(biāo)準(zhǔn)委員會,2017.

[8] 國家衛(wèi)生委和計生委,食品中玉米赤酶烯酮的測定(GB 5009.209-2016),北京:中國國家標(biāo)準(zhǔn)委員會,2017.

[9] 國家衛(wèi)生委和計生委,食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定(GB 5009.111-2016),北京:中國國家標(biāo)準(zhǔn)委員會,2017.

[10]李小明 糧食中真菌毒素快速定量檢測方法應(yīng)用比較研究[J].糧油食品科技2017,(1):54-57.

[11]李康.膠體金免疫層析技術(shù)在真菌毒素快速檢測中的應(yīng)用[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2013.(1):201-204.

張新欣(1987-)，女，吉林長春人，本科，助理工程師。研究方向：糧油質(zhì)量檢驗。