于淑娟 王智明 郭曉明李太鴻 艾超 郭筱兵

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510640;2.華南理工大學(xué) 廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640)

果膠是高等植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)多糖,其結(jié)構(gòu)復(fù)雜.果膠分子由聚半乳糖醛酸聚糖(HG)、I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-I)、II型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-II)、木糖半乳聚糖 (XGA)等4種特異性的結(jié)構(gòu)多糖組成,并有相應(yīng)的結(jié)構(gòu)模型[1].HG是由D-半乳糖醛酸通過(guò)α-1,4-糖苷鍵連接而成的均一多糖,而其他結(jié)構(gòu)單元?jiǎng)t大部分或完全由中性糖組成.中性糖單元種類多、連接方式復(fù)雜.據(jù)報(bào)道,組成果膠的中性糖可能多達(dá)12種.中性糖間通過(guò)復(fù)雜的糖苷鍵構(gòu)成了果膠的側(cè)鏈結(jié)構(gòu),從而影響果膠的分子構(gòu)象及物化性質(zhì)等[2- 3].根據(jù)植物來(lái)源的不同,中性糖含量介于16.0%～51.1%之間[3- 4],通常由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖等組成.

果膠中性糖的定量分析是解析果膠的結(jié)構(gòu)和功能特性的重要手段.然而,中性糖的徹底釋放和準(zhǔn)確檢測(cè)是關(guān)鍵.隨著高效陰離子交換色譜(HPAEC)、蒸發(fā)光散射(ELSD)和氣液相色譜等方法的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用[5- 6],中性糖分離與檢測(cè)難的問(wèn)題已經(jīng)解決.目前,中性糖的準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵是如何徹底地水解果膠中性糖單元.

無(wú)機(jī)酸是水解果膠中性糖最常用的預(yù)處理方法.該法采用硫酸、鹽酸、三氟乙酸(TFA)等水解試劑,在強(qiáng)酸(1～2 mol/L)、高溫(100～120 ℃)下進(jìn)行,水解條件越劇烈,中性糖的釋放越徹底,但也引發(fā)了中性糖降解的問(wèn)題[3,7].Garna等[6]建立了一種由三氟乙酸(TFA)復(fù)合果膠酶水解的方法(以下簡(jiǎn)稱Garna法),以較為溫和的方式獲得滿意的水解效果.Garna法對(duì)蘋果果膠、橘皮果膠具有良好的水解效果,但對(duì)于其他來(lái)源果膠的作用效果尚不明確.

甜菜果膠是一種新型的果膠,圍繞其結(jié)構(gòu)與功能性的研究已成為果膠領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一[8- 9].甜菜果膠結(jié)構(gòu)特殊,其中性糖含量較蘋果果膠、橘皮果膠等高[10].此外,研究證實(shí)，甜菜果膠的乳化活性與中性糖結(jié)構(gòu)及其完整性具有密切的關(guān)系[5].因此,尋找一種針對(duì)甜菜果膠中性糖的定量方法具有重要的意義.本研究在Garna法的基礎(chǔ)上,采用果膠酶復(fù)合無(wú)機(jī)酸水解甜菜果膠中性糖,并用HPAEC測(cè)定甜菜果膠中的單糖組分,以期為甜菜果膠中性糖結(jié)構(gòu)表征提供一種高效、針對(duì)性強(qiáng)的檢測(cè)方法.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

自制甜菜果膠(編號(hào)1、2、3),制備方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[11]; 果糖，純度≥97%,阿拉伯糖,純度≥98%,鼠李糖、半乳糖、木糖,純度≥99%,美國(guó)Sigma-Aldrich Chemical 公司產(chǎn)品; 葡萄糖(分析純),上海博奧生物科技有限公司產(chǎn)品;果膠酶(Rapidase C80),荷蘭DSM公司產(chǎn)品; 復(fù)合植物水解酶(Viscozyme L),丹麥Novozymes公司產(chǎn)品; Pectinase PL,日本Amano公司產(chǎn)品; 三氟乙酸(分析純),上海Aladdin生化科技股份有限公司產(chǎn)品; 氫氧化鈉，50%(色譜純),德國(guó)Merck公司產(chǎn)品; 其他試劑均為分析純.

ICS- 5000型陰離子交換色譜系統(tǒng),配備電化學(xué)檢測(cè)器(ED50),美國(guó)Dionex公司生產(chǎn); Waters 600型高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司生產(chǎn); RO10型磁力攪拌器,德國(guó)IKA公司生產(chǎn); FE20型數(shù)顯pH計(jì),瑞士Mettler-Toledo公司生產(chǎn); 玻璃消解管,美國(guó)HACH公司生產(chǎn); HH-2型數(shù)顯恒溫水浴槽,常州澳華儀器有限公司生產(chǎn);DF- 101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限公司生產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果膠酶液內(nèi)源性單糖的測(cè)定

選取C80、Viscozyme L(簡(jiǎn)稱為VL)、PL 3種果膠酶制劑,分析自身攜帶的小分子糖的含量及組成.將酶液用去離子水稀釋1 250倍,取5 mL于密封消化管中,100 ℃滅酶5 min,備用.

采用透析法除去果膠酶液中的小分子糖等物質(zhì),比較小分子糖含量在透析前后的變化.將酶液用20 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)稀釋25倍后,置于20 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)中，4 ℃透析30 h(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 000～3 500),每6 h更換透析廢液.透析結(jié)束后,用同樣的緩沖液稀釋至100 mL,4 ℃儲(chǔ)藏不超過(guò)48 h,備用.酶液過(guò)0.45 μm濾膜,待HPAEC分析用.

1.2.2 兩步法水解甜菜果膠

甜菜果膠的水解程序基于Garna法,但有所改動(dòng)(見(jiàn)圖1).準(zhǔn)確稱取10.0 mg左右的樣品于密封消化管中,加入4 mL 0.2 mol/L TFA,密封后于80 ℃恒溫油浴水解72 h.酸解結(jié)束后,用氨水調(diào)pH值至7,再用蒸餾水稀釋定容至25 mL.取上述水解液 4 mL于密封消化管中,等體積加入純化后的果膠酶液,于50 ℃水解24 h.水解液經(jīng)滅酶(100 ℃、5 min)、過(guò)膜(0.45 μm)后,用HPAEC分析.平行測(cè)定3次.

圖1 Garna法與本研究分別采用的水解程序

Fig.1 Hydrolyzing procedures of the Garna method and the proposed method in this paper

1.2.3 果膠酶酶解時(shí)間的確定

根據(jù)1.2.1節(jié)研究結(jié)果篩選目的果膠酶,在最佳酶解pH(5.0)、溫度(50 ℃)條件下,優(yōu)化其酶解甜菜果膠的最佳時(shí)間.配制2 mg/mL的甜菜果膠溶液，取2 mL果膠溶液于密封消化管中,加入2 mL C80果膠酶溶液,置于50 ℃水浴酶解(1～24 h).水解液滅酶，稀釋定容至25 mL.過(guò)膜,待HPAEC分析用.平行測(cè)定3次.

1.2.4 TFA酸解條件的優(yōu)化

根據(jù)1.2.3節(jié)最佳酶解條件制備酶解樣品.滅酶后,加等體積TFA溶液以調(diào)節(jié)溶液的酸濃度.考察TFA濃度(1 mol/L和2 mol/L)、酸解溫度(100、110、120 ℃)、酸解時(shí)間(1～5 h)對(duì)水解效果的影響.酸解結(jié)束后,水解液用濃氨水調(diào)pH值至7,稀釋定容至 25 mL,過(guò)膜,待HPAEC分析用.平行測(cè)定3次.

1.2.5 色譜條件

采用HPAEC法測(cè)定甜菜果膠中性糖含量，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[11].

半乳糖醛酸測(cè)定條件:高效陰離子分析柱CarboPac PA 200 (4×250 mm,美國(guó)戴安公司)和CarboPac PA 200保護(hù)柱(4×50 mm,美國(guó)戴安公司),由電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)樣品; 淋洗條件:0～5 min,100 mmol/L NaOH,5～13 min,100 mmol/L NaOH,150 mmol/L CH3COONa,13～20 min,500 mmol/L NaOH; 流速0.5 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量25 μL.根據(jù)峰面積大小,采用外標(biāo)法(y=1.787 2x-0.216 2,r2=0.999 9)對(duì)半乳糖醛酸進(jìn)行定量.

相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線測(cè)定:利用體積排阻色譜法測(cè)定甜菜果膠及其水解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線[12].

2 結(jié)果與討論

2.1 果膠酶液內(nèi)源性單糖分析

本研究采用HPAEC法測(cè)定3種果膠酶自身攜帶的小分子糖的含量及組成,以便為果膠酶篩選提供參考,并排除自身攜帶的小分子糖對(duì)分析結(jié)果的干擾.結(jié)果表明,3種果膠酶自身均含小分子糖,但單糖的種類因酶種類而異(見(jiàn)表1).VL的單糖含量為67.1 mg/mL,所含葡萄糖高達(dá)40.1 mg/mL,是3種果膠酶中單糖含量最高的.值得注意的是,VL所含單糖種類繁多,除了半乳糖、萄葡糖、木糖外,還含有果糖(22.7 mg/mL).PL含有4種單糖,含量由高到低依次為:半乳糖>木糖>阿拉伯糖>葡萄糖,4種單糖含量總和達(dá)7.00 mg/mL.C80自身攜帶小分子糖種類最少,由少量的半乳糖、葡萄糖和木糖組成.上述結(jié)果表明,果膠酶液中的單糖將干擾檢測(cè)結(jié)果,最終導(dǎo)致總中性糖含量偏高.

對(duì)果膠酶液進(jìn)行透析,以降低果膠酶自身攜帶小分子糖的含量.結(jié)果表明,C80、PL酶液經(jīng)透析稀釋至100倍后,各單糖含量均低于檢測(cè)限,而VL透析酶液的單糖總量則降低為初始含量的1/8左右.

表1 果膠酶液內(nèi)源性單糖含量1)

Table 1 Sugar composition of commercial pectinase mg/mL

果膠酶鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖木糖果糖中性糖C80——1.100.200.10—1.40PL—0.805.000.101.10—7.00VL——2.6040.101.7022.7067.10VL-透析——0.303.201.603.108.20

1)單糖含量是指每毫升酶液中的單糖質(zhì)量(mg)，為兩次平行測(cè)定的平均值.

2.2 果膠酶種類對(duì)Garna法水解效果的影響

本研究采用Garna法水解程序,讓甜菜果膠在TFA溶液中(0.2 mol/L)水解為低聚物,再用不同果膠酶進(jìn)一步水解中性糖單元.為比較單獨(dú)酸水解、酸復(fù)合酶水解的效果,采用體積排阻色譜法(HPSEC)測(cè)定不同酶解液的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線.如圖2所示,甜菜果膠(見(jiàn)圖2中對(duì)照組)具有典型的寬分布相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線(9～15 min).經(jīng)TFA酸解72 h后(見(jiàn)圖2中0.2 mol/L TFA,72 h),甜菜果膠相對(duì)分子質(zhì)量急劇下降,相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線后移、變窄(14～16 min).隨后,水解液中的甜菜果膠繼續(xù)被C80(見(jiàn)圖2中0.2 mol/L TFA,72 h+C80)、VL(見(jiàn)圖2中0.2 mol/L TFA,72 h+VL)水解.比較C80與VL酶解后的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線發(fā)現(xiàn),C80對(duì)甜菜果膠的大分子組分(14～15 min)的水解能力更強(qiáng).值得注意的是,雖然C80的酶解效果更好,但其無(wú)法將甜菜果膠徹底水解為單糖.以上結(jié)果表明,不僅TFA的酸解效果有限,且TFA復(fù)合酶法后也未能將甜菜果膠徹底水解為單糖.

如表2所示,不同果膠酶對(duì)甜菜果膠的輔助水解效果具有顯著的影響.3種果膠酶的水解能力從高到低依次為:C80>VL>PL.C80對(duì)甜菜果膠的阿拉伯糖、半乳糖單元的輔助水解效果更好,在C80參與下,Garna法水解得到的阿拉伯糖和半乳糖兩種單糖的總量,分別為VL、PL的1.1倍、1.2倍.

研究證實(shí),甜菜果膠鼠李糖含量(高達(dá)5.0%)高于商品化果膠[12- 13].然而,本研究測(cè)得的甜菜果膠鼠李糖含量?jī)H為1.2%～1.9%,與報(bào)道的數(shù)據(jù)不符,這說(shuō)明Garna等[6]報(bào)道的水解程序不足以徹底水解甜菜果膠的鼠李糖.盡管Garna等[6]的研究結(jié)果表明VL能水解橘皮果膠、蘋果渣果膠的中性糖.但對(duì)于甜菜果膠而言,由鼠李糖組成的RGI結(jié)構(gòu)區(qū)域更多,這可能不利于酶解的進(jìn)行.據(jù)報(bào)道,VL是由阿拉伯聚糖酶、半纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等組成的復(fù)合酶[14].可能是VL含有木聚糖酶活性較高的緣故,其水解液中的木糖含量最高(1.1%).與VL相比,C80對(duì)木糖的酶切活性次之,PL的木糖活性則最低.

圖2 酸法及酶-酸復(fù)合水解對(duì)甜菜果膠相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響

Fig.2 Effects of acid and enzyme-acid hydrolyses on relative molecular weight distribution

表2 果膠酶對(duì)甜菜果膠中性糖水解效果的影響

Table 2 Effects of commercial pectinase on enzymatic hydrolysis of neutral sugars of sugar beet pectin %

果膠酶鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖木糖中性糖C801.5±0.027.2±0.018.3±0.013.1±0.120.9±0.1021.0±0.22VL1.9±0.346.6±0.487.3±0.362.6±0.021.1±0.0319.6±0.55PL1.2±0.026.4±0.026.2±0.003.5±0.130.6±0.1418.0±0.25

由于C80的酶解效果好且雜糖少(見(jiàn)表1),故本研究以C80作為目的果膠酶,并進(jìn)一步優(yōu)化C80的酶解時(shí)間.

2.3 C80酶解條件

如圖3所示,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),阿拉伯糖、半乳糖逐漸從果膠分子上釋放出來(lái),酶解15 h后兩者含量分別達(dá)到3.5%、4.1%.C80對(duì)鼠李糖、葡萄糖、木糖等的水解能力十分有限,這3種單糖的含量始終低于1.0%.由此確定C80酶解時(shí)間為15 h.

果膠酶C80對(duì)鼠李糖、葡萄糖、木糖的酶解長(zhǎng)達(dá)20 h時(shí),這3種單糖的含量仍未見(jiàn)明顯升高.因此,單獨(dú)采用果膠酶C80無(wú)法徹底水解甜菜果膠,需聯(lián)合其他方法才能獲得更高的水解率.

2.4 TFA酸解條件

多種無(wú)機(jī)酸可用于水解果膠多糖[9].但由于在1 mol/L TFA、100 ℃的條件下(見(jiàn)圖4(a)),各糖苷鍵逐漸被水解.酸解2 h后,阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖基本達(dá)到峰值,相應(yīng)含量分別為8.4%、10.4%、1.0%.隨后,進(jìn)一步延長(zhǎng)酸解時(shí)間至5 h,上述3種單糖并未發(fā)生降解,這與Garna等[6]的研究結(jié)果一致.值得注意的是,葡萄糖含量始終處于較低水平,不依賴于酸濃度、酸解溫度等,這可能是葡萄糖單元已被C80水解完全.

圖3 pH 5、50 ℃時(shí)C80酶解甜菜果膠結(jié)果

Fig.3 Enzymatic hydrolysis results of sugar beet pectin by C80 at pH 5 and 50 ℃

維持酸解溫度100 ℃不變,將TFA濃度增大為2 mol/L(見(jiàn)圖4(b)),部分單糖含量的變化趨勢(shì)不變.然而,鼠李糖含量在2～5 h內(nèi)逐漸升高至3.0%,而阿拉伯糖含量則在2～5 h內(nèi)逐漸從8.9%下降至7.3%.Thibault等[15]發(fā)現(xiàn)Rha-GalA的糖苷鍵穩(wěn)定性較高,其耐酸性強(qiáng)于其他糖苷鍵.據(jù)此,在相同酶解溫度下(100 ℃),1 mol/L TFA不足以完全破壞鼠李糖與半乳糖醛酸間的糖苷鍵; 2 mol/L TFA水解鼠李糖的能力更強(qiáng),但也導(dǎo)致阿拉伯糖降解.

當(dāng)TFA濃度為1 mol/L時(shí),將酸解溫度由100 ℃提高至110 ℃后,中性糖的水解速度顯著升高(見(jiàn)圖4(c)).在此條件下,阿拉伯糖、半乳糖、木糖等在水解1 h后迅速達(dá)到峰值.鼠李糖含量隨酸解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,在4 h時(shí)達(dá)到峰值(3.4%),此時(shí)的鼠李糖含量約為100 ℃下最高值的3.4倍.隨著酸解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至5 h,阿拉伯糖、鼠李糖含量開(kāi)始緩慢下降,這表明阿拉伯糖、鼠李糖發(fā)生降解.當(dāng)酸解條件為110 ℃、2 mol/L TFA時(shí)(見(jiàn)圖4(d)),阿拉伯糖和木糖在水解1 h后達(dá)到峰值.隨后,由于高溫和強(qiáng)酸的雙重作用,阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等均出現(xiàn)不同程度的降解.

圖4 TFA酸解甜菜果膠結(jié)果 Fig.4 Acid hydrolysis results of sugar beet pectin by TFA

如圖4(e)所示,在1 mol/L TFA、120 ℃的酸解條件下,經(jīng)酸解1 h后,阿拉伯糖、木糖的含量均迅速上升至峰值.然而,當(dāng)酸解時(shí)間超過(guò)3 h后,阿拉伯糖、半乳糖的含量開(kāi)始下降,但木糖的含量卻保持穩(wěn)定.有異于其他中性單糖,鼠李糖含量在前3 h內(nèi)逐漸升高至峰值(3.2%),隨后出現(xiàn)輕微的下降.當(dāng)TFA濃度升高至2 mol/L(見(jiàn)圖4(f))后,阿拉伯糖、半乳糖提前發(fā)生降解(2 h).此外,鼠李糖含量達(dá)到峰值所需的酸解時(shí)間也縮短為2 h.

以上研究結(jié)果(見(jiàn)圖4)表明,不同中性糖單元間的糖苷鍵具有不同的耐酸性,且不同游離中性糖在強(qiáng)酸溶液中的穩(wěn)定性也存在顯著差異.束縛鼠李糖的糖苷鍵很穩(wěn)定,只有高溫、強(qiáng)酸才能將其徹底水解,但劇烈的酸解條件也引發(fā)阿拉伯糖與半乳糖的降解.因此,酸解程序的確定需要權(quán)衡鼠李糖的水解率與阿拉伯糖、半乳糖的保留率間的關(guān)系.

對(duì)于甜菜果膠而言,富含鼠李糖是它的重要結(jié)構(gòu)特征.鼠李糖的準(zhǔn)確定量對(duì)于揭示甜菜果膠的結(jié)構(gòu)特征及功能關(guān)系具有重要的意義.因此,在確定酸解程序時(shí),優(yōu)先考慮鼠李糖的水解率.綜合考慮上述因素,最終確定酸解條件為：TFA濃度1 mol/L,溫度110 ℃,酸解時(shí)間4 h.

測(cè)定了各標(biāo)準(zhǔn)單糖在最適水解條件(1 mol/L TFA,110 ℃和4 h)下的降解率,以便從側(cè)面反映甜菜果膠中性糖在該條件下的降解程度.結(jié)果表明,游離鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的降解率分別為11.4%、12.0%、9.7%、8.9%以及18.6%.對(duì)于實(shí)際果膠樣品而言,只有當(dāng)中性糖轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x單糖后,這些單糖才能進(jìn)而被降解.因此,在相同水解條件下,樣品中性糖的實(shí)際降解率應(yīng)更低.在最適水解條件下,糖苷鍵的水解與單糖的降解并存.盡管甜菜果膠的中性單糖也發(fā)生一定程度的降解,但各組成單糖的水解率仍較為理想.

2.5 果膠酶-酸法復(fù)合水解對(duì)甜菜果膠大分子結(jié)構(gòu)的影響

為驗(yàn)證C80復(fù)合酸法的水解效果,采用HPSEC技術(shù)分析了甜菜果膠的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線.如圖5所示,經(jīng)C80復(fù)合酸法處理后,甜菜果膠的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線發(fā)生顯著的變化.酶解前,甜菜果膠的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線(見(jiàn)圖5中對(duì)照組)為典型的寬分布曲線(峰1,9～15 min).經(jīng)C80酶解后(見(jiàn)圖5中C80酶解),大分子物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)化為小分子組分(峰2).此外,在TFA的進(jìn)一步水解作用下(見(jiàn)圖5中C80酶解-酸解),大分子物質(zhì)徹底水解成聚合度大于2的多糖組分(峰3).

為了進(jìn)一步明確峰3是否為半乳糖醛酸聚合物,采用HPAEC分析了水解液中的游離半乳糖醛酸含量,測(cè)得水解液中游離的半乳糖醛酸含量為37.9%.然而,由3-苯基酚顯色法[16]測(cè)定的總半乳糖醛酸含量卻為61%.以上結(jié)果表明,水解液中含有23.1%的半乳糖醛酸以聚合的形式存在,從而間接證明峰3(見(jiàn)圖5)為半乳糖醛酸低聚物.

圖5 甜菜果膠在酶-酸復(fù)合水解過(guò)程中的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線

Fig.5 Relative molecular weight distribution profiles of sugar beet pectins during the enzyme-acid hydrolysis

2.6 方法的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

根據(jù)2.3、2.4節(jié)研究結(jié)果確定兩步法水解工藝,并對(duì)該法的穩(wěn)定性、重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證.如表3所示為平行測(cè)定5次的結(jié)果,雖然受試3個(gè)甜菜果膠樣品的中性糖含量各異,但同一樣品的中性單糖含量具有良好的平行性.這說(shuō)明兩步水解法具有可重復(fù)性,能滿足樣品檢測(cè)的要求.

表3 C80-酸法對(duì)甜菜果膠的水解效果

Table 3 Hydrolyzing effect of C80-acid method toward sugar beet pectins %

甜菜果膠鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖木糖中性糖13.7±0.116.1±0.218.9±0.300.8±0.072.5±0.1622.0±0.2825.1±0.224.7±0.239.3±0.190.4±0.030.8±0.0320.3±0.5033.8±0.222.6±0.099.9±0.370.5±0.030.6±0.0617.5±0.05

3 結(jié)論

本文建立了一種定量分析甜菜果膠中性糖的方法,該方法涉及樣品前處理、高效陰離子交換色譜檢測(cè)等兩部分.樣品預(yù)處理程序依次通過(guò)C80酶解(pH 5、50 ℃、15 h)、TFA酸解完成; 單糖通過(guò)Carbopac PA1分析柱、電化學(xué)檢測(cè)器分別進(jìn)行分離、檢測(cè).TFA酸解溫度為110 ℃時(shí),有利于鼠李糖的充分水解,但阿拉伯糖、半乳糖容易發(fā)生降解.綜合考慮中性糖的水解率及降解率,最終確定TFA酸解條件為:TFA濃度1 mol/L,溫度110 ℃,酸解時(shí)間4 h.兩步水解法具有良好的水解穩(wěn)定性、重復(fù)性,結(jié)合HPAEC檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)甜菜果膠中性糖的準(zhǔn)確定量.

[1] MOHNEN D.Pectin structure and biosynthesis [J].Current Opinion in Plant Biology,2008,11(3):266- 277.

[2] BRACCINI I,GRASSO R P,PéREZ S.Conformational and configurational features of acidic polysaccharides and their interactions with calcium ions:a molecular modeling investigation [J].Carbohydrate Research,1999,317(1):119- 130.

[3] BIERMANN C J.Hydrolysis and other cleavages of glycosidic linkages in polysaccharides [J].Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,1988,46(1):251- 271.

[4] MCFEETERS R.Changes in pectin and cellulose during processing [J].Chemical Changes in Food During Processing,1985,38(3):347- 372.

[5] 王艷穎,胡文忠,龐坤,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定蘋果中可溶性糖的含量 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(6):129- 131.

WANG Yan-ying,HU Wen-zhong,PANG Kun,et al.Determination of the soluble sugars in apple by high perfor-mance liquid chromatograghy with evaporative light sacttering detcctor (HPLC-ELSD) [J].Food and Fermentation Industries,2008,34(6):129- 131.

[6] GARNA H,MABON N,WATHELET B,et al.New me-thod for a two- step hydrolysis and chromatographic analysis of pectin neutral sugar chains [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(15):4652- 4659.

[7] De RUITER G A,SCHOLS H A,VORAGEN A G,et al.Carbohydrate analysis of water-soluble uronic acid-containing polysaccharides with high-performance anion-exchange chromatography using methanolysis combined with TFA hydrolysis is superior to four other methods [J].Ana-lytical Biochemistry,1992,207(1):176- 185.

[8] FISHMAN M L,CHAU H K,QI P X,et al.Physico-che-mical characterization of protein-associated polysaccharides extracted from sugar beet pulp [J].Carbohydrate Polymers,2013,92(2):2257- 2266.

[9] WILLIAMS P A,SAYERS C,VIEBKE C,et al.Elucidation of the emulsification properties of sugar beet pectin [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(9):3592- 3597.

[10] SAKAMOTO T,SAKAI T.Analysis of structure of sugar-beet pectin by enzymatic methods [J].Phytochemistry,1995,39(4):821- 823.

[11] GUO X,MENG H,ZHU S,et al.Stepwise ethanolic precipitation of sugar beet pectins from the acidic extract [J].Carbohydrate Polymers,2016,136(2):316- 321.

[12] YAPO B,ROBERT C,ETIENNE I,et al.Effect of extraction conditions on the yield,purity and surface pro-perties of sugar beet pulp pectin extracts [J].Food Chemistry,2007,100(4):1356- 1364.

[13] LEVIGNE S,RALET M-C,THIBAULT J-F.Characterisation of pectins extracted from fresh sugar beet under different conditions using an experimental design [J].Carbohydrate Polymers,2002,49(2):145- 153.

[14] S?RENSEN H,R MEYER A,S PEDERSEN S.Enzyma-tic hydrolysis of water-soluble wheat arabinoxylan.1.synergy betweenα-L-arabinofuranosidases,endo- 1,4-β-xylanases,andβ- xylosidase activities [J].Biotechnology and Bioengineering,2003,81(6):726- 731.

[15] THIBAULT J-F,RENARD C M,AXELOS M A,et al.Studies of the length of homogalacturonic regions in pectins by acid hydrolysis [J].Carbohydrate Research,1993,238(93):271- 286.

[16] BLUMENKRANTZ N,ASBOE-HANSEN G.New method for quantitative determination of uronic acids [J].Analytical Biochemistry,1973,54(2):484- 489.