異源蛋白在絲狀真菌中高效表達(dá)策略研究進(jìn)展

通過微生物來表達(dá)蛋白越來越受到青睞，相比于其它表達(dá)系統(tǒng)，絲狀真菌具有表達(dá)量大、分泌率高、分子折疊和修飾系統(tǒng)接近高等真核細(xì)胞等特點(diǎn)，使其能進(jìn)行各種翻譯后加工，此外絲狀真菌還具有良好的安全性，發(fā)酵程序較成熟，且成本較低，越來越受到人們的重視。

在絲狀真菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的同源或異源蛋白很多，但是酶的高效表達(dá)與多個(gè)因素相關(guān)：宿主自身的特征，插入的外源基因或表達(dá)宿主自身的特征以及兩者之間的不相容性或者相互影響而產(chǎn)生的一系列變化，使目的蛋白基因在表達(dá)宿主中很難實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)在絲狀真菌中異源蛋白的高效表達(dá)，可以從兩個(gè)方面來控制，一方面提高目的蛋白的表達(dá)量；另一方面抑制其它蛋白的分泌。其策略也可以從兩方面來控制：一是外界條件，主要包括pH、溫度、培養(yǎng)基等；二是基因的構(gòu)建，主要包括使用高效強(qiáng)啟動(dòng)子、使用融合蛋白、使用轉(zhuǎn)錄因子、使用CCAAT圖案的功能元件、構(gòu)建蛋白酶缺陷株、增強(qiáng)基因拷貝數(shù)、構(gòu)建高效的表達(dá)盒子、使用CRISPR/Cas9技術(shù)來編輯基因等。

外界條件的優(yōu)化

不同的蛋白生長條件是不一樣的，適應(yīng)目的蛋白的條件不一定適應(yīng)其它蛋白，那么可以通過改變外界的條件，間接地抑制其它蛋白的產(chǎn)生，從而促進(jìn)目的蛋白的生長。不同的生長環(huán)境和不同的培養(yǎng)方法，都會(huì)影響異源蛋白的表達(dá)。菌體的生長反過來也會(huì)改變培養(yǎng)基的流動(dòng)性，造成碳源、氮源、氧氣和pH值等在發(fā)酵罐中分布不均。那么通過對(duì)接種量、碳源、氮源、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間以及pH的優(yōu)化，可以提高目的蛋白的活力。

基因的構(gòu)建

使用強(qiáng)啟動(dòng)子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，為使絲狀真菌能高效分泌異源蛋白，往往選用一些宿主自身的強(qiáng)啟動(dòng)子來進(jìn)行調(diào)控。王兵兵成功構(gòu)建了具有潮霉素B抗性標(biāo)記的重組質(zhì)粒pHB9，其中將來自黑曲霉的纖維二糖酶基因插入強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1(包括分泌信號(hào)肽序列)和來自里氏木霉的Tcbh1終止子，從而提高蛋白的表達(dá)量。構(gòu)建蛋白酶缺陷株。研究發(fā)現(xiàn)絲狀真菌自身表達(dá)的蛋白酶能夠明顯影響異源蛋白的產(chǎn)量，那么可以根據(jù)這一特點(diǎn)，采取誘變或基因敲除等技術(shù)篩選出特異的蛋白酶缺陷的絲狀真菌突變株，有的實(shí)驗(yàn)采用SMD1168蛋白酶缺陷性菌株，其Pep4基因突變，無蛋白水解酶活性，對(duì)表達(dá)的外源性蛋白產(chǎn)物降解極小，可明顯提高蛋白表達(dá)量。增強(qiáng)基因拷貝數(shù)。引入多拷貝的表達(dá)載體，一般可以提高表達(dá)量。楊紹輝等人采用修飾信號(hào)肽，增加基因拷貝數(shù)的方法，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。一般地說，目的基因整合到基因組中拷貝數(shù)越多，其轉(zhuǎn)化子zeocin的抗性越強(qiáng)。因此，利用高濃度的zeocin平板可篩選到高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。使用轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子能控制基因的轉(zhuǎn)錄，可以調(diào)控RNA聚合酶與DNA模板的結(jié)合。通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子hacA的活化形式可以實(shí)現(xiàn)黑曲霉中未折疊蛋白反應(yīng)通路的組成型誘導(dǎo)，改善mRNA水平，從而提高外源蛋白的生產(chǎn)。使用CCAAT圖案的功能元件。CCAAT圖案被認(rèn)為是真核生物中大量基因的高水平表達(dá)所必需的功能元件。它特異性結(jié)合蛋白激活物，然后引發(fā)一系列導(dǎo)致高水平基因表達(dá)的相互作用。通過將多個(gè)拷貝的含有CCAAT的蛋白質(zhì)結(jié)合序列引入啟動(dòng)子來改善黑曲霉中的異源基因表達(dá)。構(gòu)建高效的表達(dá)盒子。隨著研究的不斷進(jìn)行，出現(xiàn)了以上傳統(tǒng)的提高外源基因表達(dá)策略的兩種相結(jié)合使用，出現(xiàn)了表達(dá)盒，有研究表明，使用組合型的強(qiáng)啟動(dòng)子以及增加異源基因的整合拷貝數(shù)的方法進(jìn)行表達(dá)，但是其表達(dá)效果不是很好，其原因可能是在進(jìn)行外源基因整合時(shí)，其整合的拷貝數(shù)是不確定的。所以說表達(dá)盒由于外源基因整合的隨機(jī)性，使表達(dá)量的結(jié)果不太樂觀。

CRISPR/Cas9技術(shù)。該技術(shù)是利用靶點(diǎn)特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割導(dǎo)致突變。使用該系統(tǒng)，內(nèi)源基因組中的DNA序列及其功能輸出可以在幾乎任何選擇的生物體中容易地編輯或調(diào)節(jié)。CRISPR/Cas9技術(shù)可以定向的敲除基因，敲除率幾乎達(dá)到了100%，但是有的敲除率比較低，經(jīng)研究表明載體構(gòu)建時(shí)選擇的啟動(dòng)子以及選擇的策略不同，都會(huì)影響基因的敲除率，為了提高基因編輯效率最好選用同源強(qiáng)啟動(dòng)子。脫靶效應(yīng)一直是該技術(shù)需要克服的重大技術(shù)問題。

隨后，在一項(xiàng)新的研究中，韓春雨發(fā)現(xiàn)來自格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi）的一種Argonaute蛋白（NgAgo）作為一種核酸內(nèi)切酶，在向?qū)NA（guide DNA,gDNA）的引導(dǎo)下，能夠在人細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯，通過設(shè)計(jì)進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NgAgo-gDNA具有廣泛的基因組靶向范圍和較低的錯(cuò)配耐受性，NgAgo能準(zhǔn)確地將DNA片段插入到基因組中，與Cas9-sgRNA相比，NgAgo-gDNA具有更大的優(yōu)勢(shì)，規(guī)避了脫靶效應(yīng)，其應(yīng)用前景是不言而喻的。

問題分析

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，目前大多數(shù)還是使用傳統(tǒng)的改造基因構(gòu)造的策略，比如使用強(qiáng)啟動(dòng)子，增強(qiáng)基因的拷貝數(shù)，構(gòu)建融合蛋白等，來提高異源蛋白的表達(dá)量，但是CRISPR/ Cas9技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法上的不足，能更加準(zhǔn)確地切割特定的位點(diǎn)，但是在查閱相關(guān)文獻(xiàn)時(shí)，國內(nèi)的大部分研究依舊是傳統(tǒng)的高效表達(dá)策略，看不到與CRISPR/Cas9有關(guān)的內(nèi)容。另一方面，雖然CRISPR/Cas9成為目前基因編輯最重要也最先進(jìn)的技術(shù)，但是脫靶效應(yīng)一直是它存在的主要問題，最近有人發(fā)現(xiàn)它可能會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和破壞其他正常基因的功能，這將是CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用的一個(gè)主要問題。

近年來，隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改進(jìn)和完善以及新的基因編輯工具的出現(xiàn)，使基因編輯更加簡(jiǎn)單，但是脫靶效應(yīng)仍然存在，通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)最大可能地提高目標(biāo)活性，減少脫靶效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)更有效的遺傳篩選和基因工程。有實(shí)驗(yàn)表明Cas9脫靶活性取決于sgRNA序列和實(shí)驗(yàn)條件，如John G.Doench就構(gòu)建sgRNA活性的預(yù)測(cè)模型來發(fā)現(xiàn)改進(jìn)活性的序列特征。這為減少脫靶效應(yīng)提供了方向，此外，NgAgo-gDNA基因編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，可以預(yù)見未來的基因編輯發(fā)展的新方向，這將為基因定點(diǎn)突變、基因功能的挖掘、治療醫(yī)療疾病模型的構(gòu)建以及創(chuàng)制新的資源帶來突破性的進(jìn)展。

□ 王春麗 朱鳳妹 河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院