鄭智爽 高亞博 吳 侃 景賽賽 朱 玨 許 遠 鐘亞珍 陳素梅 余殊寰 石 蕾 吳稚冰

肝細胞癌中CK7、CK19及AFP的表達相關(guān)性研究

鄭智爽 高亞博 吳 侃 景賽賽 朱 玨 許 遠 鐘亞珍 陳素梅 余殊寰 石 蕾 吳稚冰

目的探討CK7、CK19在肝細胞癌（HCC）中的表達，以及與HCC患者甲胎蛋白（AFP）表達及臨床病理特征的關(guān)系。方法收集65例原發(fā)性HCC患者的癌組織標本及血清標本，免疫組化檢測CK7、CK19表達情況，并用ELISA法檢測血清中AFP水平。結(jié)果HCC患者癌組織中CK7的表達陽性率為46.2％（30/65），CK19表達陽性率為18.5％（12/65）。HCC癌組織中可見表達CK7、CK19的卵圓細胞，可同時表達AFP。CK19表達與血清AFP表達水平有顯著相關(guān)性（P=0.000）。結(jié)論人類HCC中同樣有卵圓細胞的存在，這部分HCC患者預(yù)后較差，AFP及CK19的聯(lián)合檢測可有助于這部分患者的早期診斷。

肝細胞癌AFP卵圓細胞CK19

人肝細胞癌（HCC）中存在少數(shù)卵圓細胞，它們既表達甲胎蛋白（AFP）和肝細胞抗原（HEP），又表達膽管標記CK7和CK19，具有雙向分化的潛能，是一類肝前體細胞或干細胞樣細胞[1]。動物實驗證實，卵圓細胞可以發(fā)生HCC、膽管上皮癌和未分化癌，說明卵圓細胞作為肝前體細胞，參與了肝腫瘤的形成[2-3]。已有研究表明，CK7、CK19陽性的HCC可能來源于卵圓細胞，這部分患者預(yù)后較差[4-5]?，F(xiàn)已證實肝炎病毒與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）是HCC發(fā)生的主要病因[6]，在人類病毒性肝炎、肝硬化的組織演變過程中均可檢測到類似動物的卵圓細胞，后者參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。本研究探討了CK7、CK19在HCC中的表達，以及與患者臨床病理特征的關(guān)系，以期對HCC患者的預(yù)后評估及治療提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料收集杭州市第一人民醫(yī)院2008至2013年的HCC患者手術(shù)切除癌組織標本65例，均經(jīng)臨床和影像學(xué)檢查證實，并根據(jù)病理組織學(xué)最終確診。其中男56例，女9例，年齡42～75歲，平均63歲。分期均為Ⅰ～Ⅱ期。所有標本組織均經(jīng)10％甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化染色。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測免疫組化采用En Vision二步法，65例HCC系列切片，常規(guī)脫臘復(fù)水，3％H2O2室溫孵育10min，微波抗原修復(fù)，分別滴加CK7（1∶100，丹麥Dako公司產(chǎn)品），CK19（1∶100，丹麥Dako公司產(chǎn)品），Hepar1（1∶50，丹麥Dako公司產(chǎn)品），4℃過夜后，二抗室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木素襯染。CK7和CK19均為腫瘤細胞胞質(zhì)染色，呈淡黃色至棕褐色為陽性。400倍光鏡下計數(shù)5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞的比例，陽性細胞＞5％判定為陽性，半定量以5％～50％為+，＞50％為++。

1.2.2 血清學(xué)檢測所有患者AFP及HBV水平均采用ELISA法檢測，AFP均為術(shù)前檢測，正常參考值A(chǔ)FP＜20ng/ml，以AFP≥20ng/m l為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者癌組織中CK7及CK19的表達情況HCC癌組織中CK7的表達陽性率為46.2％（30/65），CK19表達陽性率為18.4％（12/65），見表1。CK7和（或）CK19陽性的細胞大多體積較小，形態(tài)較一致，核圓形或卵圓形，胞質(zhì)稀少，細胞核質(zhì)比高。還有一些細胞處于中間過渡形態(tài)，與CK7陰性的腫瘤細胞有明顯區(qū)別。這些形態(tài)學(xué)特征與過去報道的肝前體細胞和移行細胞或中間表型（肝-膽管樣細胞）一致[1-4]，見圖1a細箭頭所示。

表1 65例HCC患者癌組織中CK7及CK19的表達情況[例（％）]

2.2 HCC癌組織中卵圓細胞形態(tài)學(xué)觀察HCC癌組織周圍非腫瘤組織纖維間隔內(nèi)可見大量增生的膽小管，這些膽小管均可表達CK7及CK19，其中可見CK19陽性、核卵圓、胞質(zhì)稀少的卵圓細胞，見圖1a中粗箭頭所示，這些細胞可同時表達AFP，見圖1b。

圖1 HCC患者癌組織中CK19的表達[a：癌旁纖維間隔內(nèi)可見CK19陽性表達的卵圓細胞（細箭頭所示），同時可見CK19陽性，胞質(zhì)稀少的卵圓細胞（粗箭頭所示）；b：同時表達AFP的卵圓細胞（粗箭頭所示）；En Vision二步法染色，×100]

2.3 血清AFP水平與CK7、CK19表達的關(guān)系在既往研究基礎(chǔ)上，依據(jù)AFP水平將標本分為AFP顯著升高組（＞1 000ng/ml）和AFP未顯著升高組（＜1 000ng/m l，含正常組）。AFP顯著升高組AFP水平（1 156.8～23 918.0）ng/ml，平均（7 447.1±1 450）ng/ml。AFP未顯著升高組AFP水平（3.7～851.0）ng/ml，平均（157.4±200.0）ng/ml。兩組間比較，CK7表達陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而CK19表達和腫瘤大小卻均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。兩組間性別比例、平均年齡以及血清HBsAg表達陽性率均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見表2。

表2 血清AFP水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

動物實驗證實卵圓細胞能夠在肝臟嚴重損傷、肝細胞增殖受抑制的情況下被活化，參與HCC的發(fā)生。卵圓細胞可表達CK7和CK19，而在人類多種肝臟疾病中也發(fā)現(xiàn)類似的卵圓細胞，具有相似的形態(tài)學(xué)特點，同樣可表達CK7和CK19[7-8]。本研究表明CK7、CK19均可在部分HCC中表達，CK7表達陽性率為46.2％，CK19的表達陽性率為18.5％，與文獻報道一致[4-5]。表達CK7和（或）CK19的腫瘤細胞大多體積較小，形態(tài)較一致，核圓形或卵圓形，胞質(zhì)稀少，細胞核質(zhì)比例高，與動物實驗中的卵圓細胞形態(tài)相似，提示此類表達CK7和（或）CK19的HCC可能來源于卵圓細胞的異常分化。筆者前期研究的ROC發(fā)現(xiàn)，AFP水平為1 000ng/ml的時候CK19表達陽性率在研究組和對照組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異，AUC也較AFP其它取值大，而CK7則尚無合適的AFP閾值能夠?qū)⒀芯拷M和對照組進行有效區(qū)分，因此本研究中將1 000ng/ml設(shè)定為AFP閾值。

大鼠致癌誘導(dǎo)模型的早期階段，血清AFP的升高同時伴隨卵圓細胞的出現(xiàn)，卵圓細胞可表達AFP，證實卵圓細胞可能與AFP的產(chǎn)生密切相關(guān)[3,9]。同樣AFP的持續(xù)升高是HCC患者診斷的一個重要指標，病毒感染是HCC的一個重要致病因素，人HBV以及HCV相關(guān)肝硬化的組織中均有類似的卵圓細胞存在，而且人類肝組織中的卵圓細胞也可表達AFP[7-8，10]，提示部分HCC患者AFP的異常升高可能也來源于卵圓細胞。本研究發(fā)現(xiàn)AFP顯著升高組CK19表達陽性率明顯高于AFP未顯著升高組，具有統(tǒng)計學(xué)差異，表明HCC患者中AFP水平除了與腫瘤體積大小有關(guān)外，與肝臟前體細胞的激活也有一定關(guān)系，而盡管兩組間HBsAg陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異，但卻均有很高的HBV感染率，表明HBV仍是HCC的主要病因，并可損傷肝細胞，誘導(dǎo)卵圓細胞的激活增殖，從而參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。

肝前體細胞有不同的分化階段，CK19和（或）CK7陽性表達的HCC可能具有不同的前體細胞來源。本研究中發(fā)現(xiàn)HCC癌旁組織增生的膽小管中可見CK19及AFP同時陽性表達的卵圓細胞，CK7的表達陽性率在AFP水平不同的組間并無統(tǒng)計學(xué)差異，而CK19的表達陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異，證明CK19可能是一個相對更加特異的卵圓細胞標記。已有研究表明CK19陽性的患者術(shù)后易復(fù)發(fā)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血管侵襲較常見，預(yù)后較差[5]，提示這類HCC可能來源于卵圓細胞的惡性轉(zhuǎn)化，因此CK19聯(lián)合AFP檢測對于提示卵圓細胞的存在可能更有臨床價值。

以上研究再次證實了人類HCC中同樣有卵圓細胞的存在，CK7和（或）CK19及AFP陽性的HCC可能來源于卵圓細胞的惡性轉(zhuǎn)化，而CK19陽性的卵圓細胞可能是分化更早期的肝前體細胞，活化可以伴隨AFP的高表達，因此AFP及CK19的聯(lián)合檢測有助于HCC患者的早期診斷，并有利于改善患者預(yù)后。

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ObjectiveTo investigate the exp ression of CK7 and CK19 in hepatocellular carcinoma(HCC)and its relation to c linicopathologic features.MethodsSerum and tissue sam p les were collected from 65 patients w ith HCC.The exp ression of CK7 and CK19 in HCC tissue was detected w ith immunohistochem istry,the serum AFP levels weremeasured w ith enzyme-linked immunoassay(ELISA)method.ResultsThe positive exp ression rates of CK7 and CK19 in HCC tissue were 46.2％(30/65)and 18.5％(12/65),respectively.Oval cells were detected in HCC which exp ressed CK7,CK19 and AFP.The exp ression of CK19 in HCC was significantly correlated w ith serum AFP levels(P=0.000).ConclusionThe bipotenthepatic p rogenitor cells(HPCs)in HCC exp ress CK19 and AFP,ind icating that combined detec tion of tissue CK19 exp ression and serum AFP levelmay be help ful in early d iagnosis ofhepatocellular carcinoma w ith HPCs.

HCC AFP Ovalcells CK19

2015-06-25）

（本文編輯：胥昀）

310002杭州市腫瘤醫(yī)院放療科

吳稚冰，E-mail：wu_zhibing@163.com