楊小艷 張 旭 鐘玉全

線粒體蛋白表達與原發(fā)性膽汁性肝硬化病情進展的相關性

楊小艷 張 旭 鐘玉全

目的探討線粒體蛋白對于原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）病情進展的診斷價值。方法收集120例PBC患者肝組織活檢標本，其中60例為PBC初期破壞性膽管炎期，60例為PBC終末期肝硬化期，通過AST和ALT水平、免疫組織化學染色及小膽管與膽管量化分析，探究丙酮酸脫氫酶復合-E2（PDC-E2）、細胞色素C氧化酶亞型I（CCO）、微管相關蛋白輕鏈3β（LC3）、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1與PBC病情進展的相關關系。結果PBC終末期小膽管區(qū)域的PDC-E2和CCO表達明顯高于PBC初期患者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。PBC終末期和初期患者膽管區(qū)域的PDC-E2、CCO、LC3、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。血清AST和ALT水平與兩種膽管的LC3的表達呈正相關（r=0.482、0.492、0.588、0.522，均P＜0.05），且與膽管內(nèi)p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達呈正相關（r=0.440、0.612、0.584、0.472，均P＜0.05）。結論小膽管的線粒體蛋白表達的情況也作為評估PBC疾病進展的有效標記物，與轉氨酶水平呈現(xiàn)正相關。

原發(fā)性膽汁性肝硬化線粒體蛋白進展

原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種器官特異性的自身免疫性疾病，血清中存在抗中性粒細胞抗體是其典型特征[1]。目前肝移植是終末期PBC的主要治療手段，由于很多其他肝臟的疾患能導致局部的炎癥及膽管的破壞，組織學檢測復發(fā)性PBC通常較為困難。有研究顯示PBC膽道損壞的膽管上皮細胞能夠特異性地表達線粒體抗原、自嗜體及老化標記物等，但不同病理階段其表達有可能不同，其在PBC的病理進展中發(fā)揮重要作用[2-4]。筆者針對不同病理階段的PBC患者，探究線粒體蛋白對PBC病情進展的診斷價值，以期為臨床相關疾病的診療提供借鑒及指導。

1 對象和方法

1.1 肝組織標本及處理本研究收集本院2011年3月至2015年12月120例肝組織活檢標本，其中60例診斷為PBC初期破壞性膽管炎期，60例診斷為PBC終末期肝硬化期。所有PBC患者均符合臨床、血清學及組織學診斷特征。肝組織標本固定于10％中性甲醛溶液內(nèi)，每塊組織至少切片20張（厚度4μm），每隔5張選擇一張切片進行常規(guī)蘇木精-伊紅、網(wǎng)狀蛋白及苔紅素染色，剩余切片進行免疫組織化學染色。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會和患者知情同意。

1.2 免疫組織化學染色按文獻[5]報道的方法進行免疫組織化學染色，線粒體相關抗原為丙酮酸脫氫酶復合-E2（PDC-E2）和細胞色素C氧化酶亞型I（CCO）；自噬體標記為微管相關蛋白輕鏈3β（LC3）；失調的自噬體標記p62及老化標記p16NK4a和p21WAF1/Cip1。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，將切片與一抗在4℃環(huán)境下過夜孵育，之后添加Envision溶液，室溫靜置30min，通過過氧化氫及3-3′二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽使反應物可視化。將切片輕微通過甲基氯或蘇木精進行復染色；一抗選擇使用相同稀釋度的小鼠或兔的免疫球蛋白G，進行組織學分析。研究中所使用的一抗分別為：PDC-E2（1∶100，Santa-Cruz）；CCO（1∶200，Invitrogen）；LC3（1∶50，Santa-Cruz）；p62（1∶1 000，MBL）；p16NK4a（1∶100，Neomarkers）和p21WAF1/Cip1（1∶100，BD transduction）。

1.3 免疫組織化學檢測結果量化本研究中標本切片關注的區(qū)域主要為小膽管（室間隔及小葉間膽管）及膽管（肝門附近區(qū)域內(nèi)徑較大的膽管），通過量化評分評估小膽管及膽管的免疫組織化學標記物的表達程度。小膽管的免疫組織標記評分為：0分（陰性），1分（少于3處的小膽管可見陽性細胞），2分（超過3處的小膽管可見廣泛存在的陽性細胞）；膽管的免疫組織標記評分為：0分（陰性），1分（少于1/3門靜脈可見陽性細胞），2分（超過1/3門靜脈可見廣泛存在的陽性細胞）。記錄每個標本得分數(shù)。

1.4 AST、ALT與線粒體蛋白的相關性檢測所有PBC患者血清AST、ALT水平，分析其與線粒體蛋白表達的相關性。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman分析AST、ALT與線粒體蛋白的相關性。

2 結果

2.1 小膽管各標記物表達情況PBC終末期患者小膽管的膽管上皮細胞PDC-E2呈顆粒狀及泡狀高密度表達；而在發(fā)病初期患者中小膽管內(nèi)則未見PDC-E2的明顯表達，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CCO兩者均有表達且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PBC終末期患者中小膽管可見LC3及p62的結節(jié)性表達，同樣的表達可見于初期患者的標本內(nèi)，且兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。p16INK4a及p21WAF1/Cip1僅見于兩組部分患者的小膽管內(nèi)，兩者表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1和圖1（見插頁）。

表1 兩種病變切片中小膽管區(qū)域各標記物的表達情況比較[例（％）]

2.2 膽管各標記物表達情況PBC終末期及初期患者PDC-E2、CCO、LC3、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

2.3 血清AST和ALT水平與標記物表達的相關性分析血清AST和ALT水平與兩種膽管的LC3的表達均呈正相關（均P＜0.05），同樣的相關關系亦可見于膽管內(nèi)p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達，但其余指標的表達與血清AST和ALT水平無相關性，見表3。

3 討論

有研究報道證實PBC受損的小膽管的膽管上皮線粒體蛋白的表達增加，并且可能與自噬體的失調有關[6-8]。本研究與之不同在于研究中納入了PBC早期及終末期患者標本，本研究證實了線粒體蛋白（PDC-E2和CCO）的表達在終末期PBC肝臟內(nèi)的小膽管內(nèi)更為顯著，提示其可能被用來作為終末期PBC診斷的標記物。

表2 兩種病變切片中膽管區(qū)域各標記物的表達情況比較[例（％）]

表3 血清AST和ALT水平與標記物表達的相關性分析

本研究也清晰地展示出了小膽管內(nèi)PDC-E2和CCO的表達可作為終末期PBC的有效診斷標記物，小膽管線粒體蛋白的表達與臨床及組織學診斷PBC終末期一致。與之相對應的，若小膽管無上述兩種蛋白的表達而存在LC3、p62、p16INK4或者p21WAF1/Cip1的表達，則通常相應的診斷為PBC初期，由于兩者組織病理學檢查中均可見典型的膽管損害，因此兩者的區(qū)分存在一定的困難[6,9-12]。雖然一般認為切片中顯示的膽管的肉芽腫病變即視為PBC的跡象，但實際中發(fā)現(xiàn)的概率僅為30％左右。少數(shù)文獻就相關的診斷標記物進行過探究，一項研究表明PBC初期上皮-間質的轉化可能參與了膽管的損害過程；肝移植中就PDC-E2表達免疫組織化學檢測的結果參差不齊，為此本研究提供了相關證據(jù)，但仍需要大樣本的病例進行深度確認。

本研究發(fā)現(xiàn)很多診斷為PBC初期的標本小膽管內(nèi)通?？梢奓C3、p62、p16INK4a或p21WAF1/Cip1的表達，而線粒體蛋白的表達通常很低。部分研究主要關注于小膽管內(nèi)p16INK4a或p21WAF1/Cip1的表達，PBC初期中后者的表達與膽管上皮的老化相關；在慢性同種異體肝排異及PBC內(nèi)，兩者均表現(xiàn)為肝內(nèi)膽管的進行性缺失，據(jù)報道膽管上皮的老化是最主要的機制之一[13-15]。本研究進一步證實了在PBC初期中存在小膽管的膽管上皮的老化。

本研究還發(fā)現(xiàn)PBC初期患者中小膽管多表現(xiàn)LC3和/或p62的表達，而PBC標本中各種標記物的表達概率相對較高。有研究報道在PBC的膽管上皮內(nèi)自噬體通常先于細胞的老化，體外的研究亦報道氧化應激、饑餓及疏水性膽汁酸等能夠誘導自噬體及膽管上皮的自噬體失調[16-20]。本研究發(fā)現(xiàn)標記物在PBC兩種病理改變時期中存在統(tǒng)計學差異，因此筆者設想其中相關的病理變化過程亦是不同的。

研究結果顯示AST和ALT水平與兩種膽管的LC3的表達顯著相關，同樣的相關關系亦可見于膽管內(nèi)p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達，但相關的機制仍不清楚，可能的推測為嚴重的肝臟損傷可導致干細胞及膽管上皮自噬體的失調改變。

綜上所述，本研究初步證實小膽管的線粒體蛋白表達可作為PBC終末期的有效診斷標記物。

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ObjectiveTo investigate the association between the exp ression of m itochond rial p roteins and the p rogression of p rimary biliary cirrhosis(PBC).MethodsBiopsy specimens were taken from 120 PBC patients,inc lud ing 60 cases of early stage and 60 cases of end stage.Serum AST and ALT levels were measured,and the exp ressions of pyruvate dehyd rogenase-E2(PDC-E2),cytochrome c oxidase isoform I(CCO),m icrotubule-associated p rotein light chain 3β(LC3), p62,p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in tissue sam p les were detected by immunohistochem ical staining.The correlation between the exp ression ofm itochond rial p roteins and the p rog ression of PBC was analyzed.ResultsThe exp ression of PDC-E2 and CCO in the smallbile ductarea ofend stage PBC was significantly higher than that in the early stage PBC(all P＜0.05).However, there were no significantdifferences in the exp ression of PDC-E2,CCO,LC3,p62,p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in the bile duct between end-stage and early stage PBC(all P＞0.05).The serum levels of AST and ALT were positively correlated w ith the exp ression of LC3(r=0.482,0.492,0.588,0.522,all P＜0.05)in smallbile duct and bile duct,and correlated positively w ith the exp ression of p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in the bile ducts(r=0.440,0.612,0.584,0.472,all P＜0.05).ConclusionThe exp ression ofm itochond rialp roteins in smallbile ducts is positively correlated w ith serum transam inase levels,which may be an usefulbiomarker for the d isease p rog ression of PBC.

Primary biliary cirrhosis Mitochond rialp rotein Prog ressing

2016-07-19）

（本文編輯：陳麗）

641000四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

楊小艷，E-mail：xiaoyyang1981@163.com