王 娜

(湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

人脂肪源性干細(xì)胞體外培養(yǎng)和鑒定研究

王 娜

(湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

目的 建立人脂肪源性干細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)及鑒定方法，以期為組織研究和臨床應(yīng)用提供細(xì)胞來源。方法 通過脂肪抽吸術(shù)獲取人腹壁下脂肪組織，經(jīng)過PBS液反復(fù)沖洗，I型膠原酶消化，采用直接貼壁篩選培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)，從脂肪組織中分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增細(xì)胞。相差顯微鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)特征，應(yīng)用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，檢測(cè) CD34、CD45、CD44、CD90表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物CD34、CD45表達(dá)陰性，CD44、CD90表達(dá)陽(yáng)性。結(jié)論 采用直接貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)可獲得生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖能力強(qiáng)的脂肪干細(xì)胞。

脂肪源性干細(xì)胞；原代培養(yǎng)；流式細(xì)胞檢測(cè)

脂肪干細(xì)胞存在于脂肪組織中，具有多方向分化潛能，是一種理想的脂肪組織修復(fù)種子細(xì)胞[1-3]。有研究報(bào)道它們?yōu)橹炯?xì)胞和血管的生長(zhǎng)提供相關(guān)信號(hào)，同時(shí)也可能參與損傷修復(fù)[4]。臨床上創(chuàng)傷和腫瘤常常導(dǎo)致軟組織的缺損，嚴(yán)重者甚至影響患者器官的外形和功能[5]。脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)供給脂肪,移植入體內(nèi)后排斥反應(yīng)也較少。本文通過對(duì)脂肪干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定，以期為組織研究和臨床應(yīng)用提供細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 取自咸寧中心醫(yī)院院整形外科患者腹部皮下脂肪，采取脂肪抽吸術(shù)。志愿者未患腫瘤及全身感染性疾病，共40例，年齡18～35歲，男女比例為4∶1，自愿接受整形外科脂肪抽吸手術(shù)，術(shù)前未接受放療、化療等危害人體細(xì)胞的任何治療，并簽知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)預(yù)先準(zhǔn)備：0.1%I型膠原酶(碧云天，中國(guó))，0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS液)，LG-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó))，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，0.25%胰酶-0.02%EDTA(碧云天，中國(guó))，小鼠抗人單克隆抗體CD34抗體、CD44抗體及CD45抗體、 CD90抗體(北京四正柏生物科技有限公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠單克隆抗體(invitrogen，美國(guó))，雙抗(100 U/mL 青霉素、100ng/mL鏈霉素),MTT(Sigma，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將獲取的脂肪組織立即送至實(shí)驗(yàn)室，用無菌PBS液反復(fù)沖洗。肉眼下仔細(xì)分離去除結(jié)締組織和血管成分，使用無菌眼科剪剪碎組織，以每塊組織大小約1mm3為宜。將組織小塊移至5mL離心管。向離心管中加入0.1%I型膠原酶，消化60min。離心后向離心管中加入等體積PBS液，約5mL，以1300rpm離心5min，棄上清。將獲得的細(xì)胞沉淀種植在裝有條件培養(yǎng)基(LG-DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、100ng/mL鏈霉素)的無菌培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24～48h后，觀察細(xì)胞貼壁即可進(jìn)行第一次換液，此后每隔3d換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合后進(jìn)行傳代。將單細(xì)胞懸液移至離心管中，離心 (1000rpm,5min)，棄上清，加入完全培養(yǎng)基，輕吹使之松散，按1∶2傳代培養(yǎng)。選取P3代細(xì)胞，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度約90%時(shí)，胰酶消化離心，棄上清后加3mL培養(yǎng)基混勻；另取一支新的15mL無菌離心管，裝入約9mL培養(yǎng)基，在3mL細(xì)胞懸液中取出1mL加入到離心管中，混勻，此時(shí)細(xì)胞濃度大約1×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻。取5個(gè)96孔板，細(xì)胞孔設(shè)定為6孔，每孔加入100μL，邊緣孔用無菌PBS填充，調(diào)零孔使用等體積培養(yǎng)基。每隔1d取出一塊培養(yǎng)板，吸出培養(yǎng)液，PBS液洗2次，每孔各加入10μL MTT(5mg/mL，即0.5%MTT)溶液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

通過胰酶消化將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上洗脫，制成細(xì)胞懸液，收集到離心管中，調(diào)整細(xì)胞濃度約1×105個(gè)/mL，以1000r/min，5min離心，棄上清；加1mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，各取100μL細(xì)胞懸液分別加入4支EP管，依次加入小鼠抗人單克隆抗體CD34、CD44、CD45、CD90(1∶100稀釋)1μL，避光，冰上孵育30min；PBS液沖洗，確保去掉未結(jié)合的抗體。再次加100μL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；加入以FITC標(biāo)記二抗(1∶50稀釋)2μL，充分振蕩，室溫下避光培養(yǎng)1h；PBS液沖洗，離心棄上清，重復(fù)操作。加入200μL PBS溶液重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

細(xì)胞培養(yǎng)4d后，細(xì)胞呈圓形，部分貼壁。每次細(xì)胞換液之前，培養(yǎng)基中仍可見懸浮圓球狀細(xì)胞，換液時(shí)將之去除。到第6d，鏡下視野細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯增多，呈魚群樣生長(zhǎng)。細(xì)胞由短梭形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，細(xì)胞胞體狹長(zhǎng)，排列有序，此后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，集落數(shù)目明顯增多，逐漸融合成片狀(圖1，封二)。第8d細(xì)胞相互融合，有時(shí)可見滿視野細(xì)胞密集生長(zhǎng)(圖2，封二)。

細(xì)胞傳代之后生長(zhǎng)速度變快，增殖迅速，鏡下觀察細(xì)胞背景干凈，雜質(zhì)少，細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)類似(圖3、圖4，封二)。3d后細(xì)胞數(shù)量呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，細(xì)胞融合，旋渦狀生長(zhǎng)，融合率達(dá)90%，傳代時(shí)間3d左右，此后出現(xiàn)平臺(tái)期，隨著時(shí)間的增加，顯微鏡下可見細(xì)胞胞核內(nèi)黑素增多，細(xì)胞體積變大，數(shù)量開始減少，第1～5代細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，第6代以后細(xì)胞增殖速度開始減慢，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)色素沉著，細(xì)胞數(shù)量更少,培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)雜質(zhì)。

在不同的時(shí)間點(diǎn)(1d，2d，3d，4d，5d，6d，7d)觀察P3代人脂肪源性干細(xì)胞增殖情況。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)曲線顯示，ADSCs在第1、2d增長(zhǎng)緩慢，第3d細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，隨著時(shí)間增加而增殖。第6、7d細(xì)胞增長(zhǎng)處于平臺(tái)期。整體來看，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)“S”型(圖5)。

圖5 在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察P3代人脂肪源性干細(xì)胞增殖情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物CD34，CD45表達(dá)陰性，比例分別為4.70%和4.90%；CD44，CD90表達(dá)陽(yáng)性，比例分別為12.47%和84.72%(圖6)。表明ADSCs有向其它細(xì)胞系分化潛能。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3代ADSCs表面標(biāo)記物

3 討 論

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)來源于胚胎早期或原始性腺，能夠分化的細(xì)胞系范圍廣泛，幾乎能分化為所有的細(xì)胞類型。以目前的技術(shù)水平，我們已經(jīng)能將人的胚胎干細(xì)胞成功分離出來。從脂肪組織中獲取成體干細(xì)胞有它自身的優(yōu)勢(shì)：①取材方便，損傷小；②培養(yǎng)后可以行自體移植(因?yàn)閬碜宰泽w可以排除移植后免疫排斥反應(yīng))；③不受道德倫理學(xué)的限制[6-7]。

脂肪源性干細(xì)胞分布在血管周圍并附著于細(xì)胞基質(zhì)中，有研究報(bào)道[4]它們?yōu)橹炯?xì)胞和血管的生長(zhǎng)提供相關(guān)信號(hào)，同時(shí)也可能參與損傷修復(fù)，每年平均大約超過10%的成熟脂肪細(xì)胞更替來滿足機(jī)體組織修復(fù)。在體外環(huán)境下它表現(xiàn)出更多的功能，人們相信脂肪源性干細(xì)胞同樣具備向不同細(xì)胞系分化的能力。吳尉等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)人脂肪干細(xì)胞分別經(jīng)過成脂和成骨誘導(dǎo)，可以形成成熟脂肪細(xì)胞和礦化結(jié)節(jié)，進(jìn)一步證實(shí)了脂肪干細(xì)胞具有向成脂、成軟骨、成骨分化等多向分化潛能。

ADSCs的原代培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，通常種植培養(yǎng)瓶48h后絕大部分細(xì)胞仍懸浮，本次實(shí)驗(yàn)在種植后60h才進(jìn)行細(xì)胞第一次換液，貼壁細(xì)胞橢圓形居多，貼壁不牢靠，細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏。根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，在細(xì)胞P5代以后，顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)色素沉著，增殖速度逐漸變慢，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度老化現(xiàn)象。所以提示我們：一方面，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)該同時(shí)選取幾代細(xì)胞進(jìn)行研究更為科學(xué)；另一方面，在應(yīng)用ADSCs時(shí)應(yīng)選取P5代之前細(xì)胞更有利。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD34作為造血干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34(-)排除了培養(yǎng)細(xì)胞中混有造血干細(xì)胞可能。CD45被認(rèn)為是白細(xì)胞共同抗原；CD44介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基質(zhì)間粘附作用，促進(jìn)細(xì)胞粘附與遷移；CD90是細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族成員，也是與細(xì)胞粘附、分化、細(xì)胞間相互作用有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果CD44、CD90均陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中選取的抗體檢測(cè)數(shù)量較少，而且在采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物分子后，實(shí)驗(yàn)并沒有對(duì)干細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨等分化能力進(jìn)行鑒別。這是實(shí)驗(yàn)中的不足之處，希望在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中能得到完善。雖然ADSCs表面標(biāo)志物分子種類多，也沒有特異性標(biāo)志物，但是總體說來聯(lián)合抗體檢測(cè)也不失為好的鑒別ADSCs的方法。

通過本次實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)出干細(xì)胞，并且經(jīng)過鑒定為ADSCs，接下來我們需要研究ADSCs在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮作用，怎樣將之應(yīng)用到臨床實(shí)踐中去，這也是后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究方向。

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Culture and Identification of Human Adipose Tissue Derived Stem Cells in Vitro

WANG Na

(HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To establish a method for isolation，culture and identification of human adipose-derived stem cell(ADSCs).Methods Abdominal adipose tissue was obtained from human through liposuction，washed with PBS，and then digested with type I collagenaseand cultured in vitro.The morphological characteristics of the cells were observed under a phase contrast microscope.MTT method was used to determine the growth curve and flow cytometry was adopted to detect the expression of surface antigens CD34，CD45，CD44 and CD90.Results The growth curve of human adipose-derived stem cells was opposite-like “S” shape.The stem cells showed strong positive expression of surface markers CD44，CD90 and negative expression of CD34，CD45.Conclusion Direct adherent culture in vitro can obtain adipose tissue-derived steme cells with stable growth and strong proliferation ability.

Adipose-derived stem cells;Primary culture;Flow cytometry

Q813.1

A

2095-4646(2016)06-0468-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.06.0468

2016-06-18)