葉 茂，鄭 勇，劉艷西，陳 明，胡 鋒

(湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)外科，湖北 咸寧 437100)

丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞增殖的影響

葉 茂，鄭 勇，劉艷西，陳 明，胡 鋒

(湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)外科，湖北 咸寧 437100)

目的 探討丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞增殖的影響，為丹參酮ⅡA治療骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 通過體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為四組：對照組、丹參酮ⅡA低劑量組(5 μM)、丹參酮ⅡA中劑量組(10 μM)、丹參酮ⅡA高劑量組(20 μM)。采用分光光度計(jì)測量OD值檢測成骨細(xì)胞的增殖活性；采用二乙醇胺法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性；使用流式細(xì)胞儀檢測成骨細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果 丹參酮ⅡA中、高劑量組與對照組相比OD值明顯增加(P<0.05、P<0.01)，提示其可提高成骨細(xì)胞的增殖活性。與對照組相比，丹參酮ⅡA中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性明顯升高(P<0.05)，而凋亡率則明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 參酮ⅡA能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過抑制成骨細(xì)胞的凋亡，為其臨床上用于骨質(zhì)疏松的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

丹參酮ⅡA；成骨細(xì)胞；增殖；凋亡

骨質(zhì)疏松癥是由于骨密度和骨質(zhì)量下降，從而造成骨脆性增加和易產(chǎn)生骨折的全身性骨病，其發(fā)生機(jī)制未明。骨質(zhì)疏松癥是中老年人特別是老年女性最常見的疾病之一，嚴(yán)重影響人們健康和生活質(zhì)量[1]。同時(shí)，隨著人們生活水平的提高，心血管疾病也成為中老年人常見的疾病，并且很多心血管疾病患者同時(shí)伴有骨質(zhì)疏松癥，但其發(fā)生機(jī)制尚未明確，也沒有很有效的臨床治療藥物。

丹參酮ⅡA廣泛應(yīng)用于治療心血管病，對冠心病、心絞痛、心律過速有顯著療效[2]，但對骨質(zhì)疏松的作用特別是對成骨細(xì)胞增值的影響尚未見報(bào)道。我們通過體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，觀察丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞增殖的影響，并探討其作用機(jī)制，為其臨床上用于心血管病伴有骨質(zhì)疏松癥的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 細(xì)胞：人成骨細(xì)胞株(hFOBI.19)由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

丹參酮ⅡA(純度98%，阿拉丁公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；堿性磷酸酶試劑盒(Sigma公司)；凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。其他所用試劑均為分析純。

1.2 成骨細(xì)胞培養(yǎng) 成骨細(xì)胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基和FBS，置于34℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24h后細(xì)胞將會(huì)貼壁生長，每隔2d換培養(yǎng)基一次，第8d待細(xì)胞長滿瓶底后傳代，取傳4～6代的成骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：分為對照組、丹參酮ⅡA低劑量組(5 μM)、丹參酮ⅡA中劑量組(10 μM)、丹參酮ⅡA高劑量組(20 μM)。

1.3 檢測方法

1.3.1 成骨細(xì)胞增殖活性檢測 采用CCK-8法進(jìn)行檢測。通過體外培養(yǎng)使骨細(xì)胞密度達(dá)到2×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100μL。每孔按1∶9 比例加入CCK-8，采用分光光度計(jì)在450 nm波長處檢測吸光度值(OD)，即表示成骨細(xì)胞的增殖活性。

1.3.2 堿性磷酸酶檢測 采用二乙醇胺法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性，具體按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 成骨細(xì)胞凋亡檢測 通過體外培養(yǎng)使成骨細(xì)胞密度達(dá)到2×105個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔為2 mL。加入400μL的Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞后再加入5μL的AnnexinV-FITCA，室溫避光孵育15min，600r/min離心6 min，將沉淀細(xì)胞用孵育緩沖液洗滌，然后加入10 μLPI染液，避光處理后在冰浴中放置10min，通過流式細(xì)胞儀檢測成骨細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞增殖活性的影響 分光光度法測定顯示對照組OD值為(0.574±0.042)，丹參酮ⅡA低、中、高濃度組分別為(0.601±0.054)、(0.685±0.062)、(0.721±0.082)，丹參酮ⅡA中、高濃度組成骨細(xì)胞增殖活性明顯高于對照組(P<0.05、P<0.01)，提示而丹參酮ⅡA可增加成骨細(xì)胞的增值活性，且劑量越大，效果越強(qiáng)。見圖1。

2.2 丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的影響 采用二乙醇胺法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA低、中、高濃度組明顯增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，并且隨著丹參酮ⅡA劑量增加，成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性逐漸增強(qiáng)。見圖2。

圖2 丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的影響與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；n=6

2.3 丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞凋亡的影響 對照組成骨細(xì)胞凋亡率(10.11±0.42)%，丹參酮ⅡA低、中、高濃度組凋亡率分別為(8.27±0.33)%、(7.86±0.38)%、(7.03±0.43)%，丹參酮ⅡA各濃度組成骨細(xì)胞凋亡率與對照組相比有明顯差異性(P<0.05或P<0.01)。提示丹參酮ⅡA可通過抑制成骨細(xì)胞凋亡從而增強(qiáng)其增值活性。見圖3。

圖3 丹參酮ⅡA對成骨細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；n=6

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是中老年人常見的疾病之一，可引起脊柱變形、骨折甚至致殘，從而降低患者的生活質(zhì)量，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。骨質(zhì)疏松癥發(fā)生原因有多種，可由絕經(jīng)引起，也可由內(nèi)分泌疾病、結(jié)締組織疾病或血液系統(tǒng)疾病等導(dǎo)致，其中成骨細(xì)胞的活性下降在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中起核心作用。成骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，是骨形成過程中最重要的細(xì)胞，其功能活躍狀態(tài)是成骨的關(guān)鍵因素[4]。成骨細(xì)胞數(shù)量的增加或其功能活躍都能夠發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。因此，促進(jìn)成骨細(xì)胞功能活躍或抑制成骨細(xì)胞凋亡都可成為治療骨質(zhì)疏松癥的重要方法。

丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，具有抗菌、抗炎、抗凝血、促進(jìn)傷口愈合等多種藥理作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可用于治療心血管相關(guān)疾病，其副作用小，效果顯著[5]，并且臨床還發(fā)現(xiàn)很多心血管疾病患者同時(shí)伴有骨質(zhì)疏松癥。那么丹參酮ⅡA在用于心血管疾病治療的同時(shí)是否對骨質(zhì)疏松癥也有治療作用，值得深入研究。

本研究通過體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞，并加入不同濃度的丹參酮ⅡA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA中、高濃度組可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，且劑量越大，效果越強(qiáng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可增加堿性磷酸酶活性，并且抑制成骨細(xì)胞凋亡，有一定的劑量依耐性。綜上所述，丹參酮ⅡA能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、增加堿性磷酸酶活性、抑制其凋亡，有可能用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療。此外，丹參酮ⅡA作為中老年人心血管的常用藥，不良反應(yīng)少、價(jià)格便宜，對于心血管疾病伴骨質(zhì)疏松的患者，有著較為廣泛的應(yīng)用前景。

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[2]LEE J C，PARK J H，PARK O K，et al.Neuroprotective effects of tanshinone I from Danshen extract in a mouse model of hypoxia-ischemia[J].Anat Cell Biol,2013,46(3):183

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Effect of TanshinoneⅡA on the Proliferation of Osteoblasts

YE Mao，ZHENG Yong，LIU Yan-xi，et al

(DepartmentofJointSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100，China)

Objective To investigate the effect of Tanshinone ⅡA on the proliferation of osteoblasts.Methods The osteoblasts were cultured in vitro and divided into four groups: control group，low dose of Tanshinone ⅡA group(5 μM)，middle dose of Tanshinone ⅡA group(10 μM)and high dose of Tanshinone ⅡA group(20 μM).The proliferation activity of osteoblasts was detected with CCK-8 kit.Intracellular alkaline phosphatase activity was determined by two ethanol amine method.Apoptosis rate of osteoblasts was detected by flow cytometry.Results The proliferation activity was significantly increased in middle and high doses of Tanshinone II A groups and there was statistical significance as compared to the control group(P<0.05 orP< 0.01).Compared with the control group,the activity of alkaline phosphatase activity in high dose group was increased(P<0.05)，while the apoptosis rate was decreased(P<0.05).Conclusion Tanshinone II A can promote the proliferation of osteoblasts partly by inhibiting the apoptosis of osteoblasts，which may provide experimental evidence for the treatment of osteoporosis.

Tanshinone ⅡA;Osteoblast;Proliferation;Apoptosis

R965.2

A

2095-4646(2016)06-0461-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.06.0461

2016-08-30)