文/孔祥瑞 王洪柱

（1 黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司；2 黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

文/孔祥瑞1王洪柱2

（1 黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司；2 黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

金黃色葡萄球菌是人體致病菌，被其污染的食品會(huì)由于金黃色葡萄球菌代謝的腸毒素導(dǎo)致中毒。因此，在原料乳及乳產(chǎn)品檢驗(yàn)中金黃色葡萄球菌是作為一種致病菌污染的指示菌，其檢測(cè)方法的開發(fā)和研究具有重要作用和意義。研究論述了金黃色葡萄球菌國(guó)內(nèi)和國(guó)外檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，旨在為食品生產(chǎn)提供一種快速、方便、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)。

金黃色葡萄球菌；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

金黃色葡萄球菌是廣泛存在于自然界和人體皮膚上的兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌。它存在于人體的鼻黏膜、腸道、皮膚等部位，通常不具致病性，但是皮膚化膿感染常見的病原菌[1]。雖然它不具有致病性，但其產(chǎn)生的腸毒素會(huì)導(dǎo)致中毒。食品易受其污染，導(dǎo)致人體食物中毒，主要癥狀是發(fā)燒、腹瀉和惡心嘔吐[2～3]。金黃色葡萄球菌分泌20 多種毒性蛋白質(zhì)，常見為7 種，可耐高溫，100 ℃加熱30 min不被破壞，據(jù)報(bào)道成人僅食用約100 ng腸毒素A，即可導(dǎo)致食物中毒[4]。近幾年，我國(guó)因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居全世界第4位[5]。為控制金黃色葡萄球菌的污染，應(yīng)定期檢查奶牛乳房，定期檢查工作人員健康狀況，并且應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏生牛乳。金黃色葡萄球菌在乳制品中最常見，因此金黃色葡萄球菌的檢測(cè)技術(shù)十分重要。本文對(duì)目前金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為從事金黃色葡萄球菌檢測(cè)鑒定的工作人員提供指導(dǎo)和參考。

1 金黃色葡萄球菌檢測(cè)的常規(guī)方法

食品中金黃色葡萄球菌的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法大多采用平板計(jì)數(shù)法，我國(guó)食品金黃色葡萄球菌的檢測(cè)是以GB 4789.10-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》為依據(jù)。定性檢測(cè)前先配制液體培養(yǎng)基進(jìn)行前增菌，后將混合好的培養(yǎng)物接種到血平板或Baird-Parker平板，當(dāng)培養(yǎng)終止，觀察特征，鏡檢，通過(guò)血漿凝固酶做生化鑒定。定量檢測(cè)前先將樣品稀釋，后將樣品接種到Baird-Parker平板，培養(yǎng)一定時(shí)間，計(jì)數(shù)典型菌落。金黃色葡萄球菌腸毒素可通用ELISA快速檢測(cè)試劑盒對(duì)A、B、C、D、E 5 種腸毒素型進(jìn)行檢測(cè)[6]。

2 快速檢測(cè)方法

快速檢測(cè)方法是傳統(tǒng)方法的改進(jìn)，微生物在生長(zhǎng)代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生特異性酶或其它代謝產(chǎn)物，將顯色底物加入到選擇培養(yǎng)基中，微生物生長(zhǎng)時(shí)會(huì)使其具有特殊顏色，從而分離和鑒別金黃色葡萄球菌。快速檢測(cè)方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并且能夠快速得到結(jié)果，操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單。食源性致病菌的危害是食品安全的一個(gè)重要方面。近年來(lái)，食源性致病菌污染事件頻頻發(fā)生，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同食品有相關(guān)規(guī)定，近來(lái)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)還通過(guò)了對(duì)食品中致病菌、污染物的限量規(guī)定?，F(xiàn)有致病菌的檢測(cè)技術(shù)與方法受設(shè)備、人員、環(huán)境制約，基層人員難以掌握推廣，成熟的快速檢測(cè)技術(shù)和方法是未來(lái)食源性致病菌檢測(cè)的發(fā)展方向。

2.1 測(cè)試片法

測(cè)試片法是近年來(lái)采用較廣泛的方法，是指以膠片、紙片等作為培養(yǎng)載體，將特定的顯色物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基質(zhì)附在載體上，通過(guò)在其上生長(zhǎng)的微生物代謝與顯色物反應(yīng)以測(cè)定食品中的微生物含量。其具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、污染小，無(wú)需配制試劑、無(wú)需準(zhǔn)備大量器皿，少量樣品也可測(cè)定，易于保存和消毒，方便攜帶及運(yùn)輸，能真實(shí)反映檢品中的細(xì)菌數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，但是其無(wú)法準(zhǔn)確定性計(jì)數(shù)。此法現(xiàn)在已應(yīng)用在快速檢測(cè)領(lǐng)域中，其中美國(guó)3M公司Petrifilm為載體的測(cè)試片應(yīng)用最為廣泛。該測(cè)試片主要由金黃色葡萄球菌熱穩(wěn)核酸酶片及培養(yǎng)基兩部分組成，第一部分是Baird-Parker改良后的培養(yǎng)基，第二部分是利用金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的特異性熱穩(wěn)核酸酶，盡管加熱到一定溫度，然而仍具有活性，能夠分解DNA鏈，之后與底物四唑指示劑、甲苯胺藍(lán)反應(yīng)，1～3 h后顯色，呈現(xiàn)粉紅色的圓環(huán)菌落，從而鑒定金黃色葡萄球菌。隨著國(guó)外顯色檢測(cè)技術(shù)的成熟，國(guó)內(nèi)也主要對(duì)顯色培養(yǎng)基進(jìn)行研究。

2.2 試劑盒法

試劑盒法通常將十多種，甚至幾十種培養(yǎng)基或成分集中在特定微型裝置內(nèi)，通過(guò)觀察微生物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程的某些產(chǎn)物或現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行分析，將傳統(tǒng)試驗(yàn)中多次試驗(yàn)通過(guò)一次完成，縮短了檢測(cè)時(shí)間。此法可大大縮短測(cè)試時(shí)間，在24 h內(nèi)得出結(jié)果，甚至某些可縮短至4 h內(nèi)。目前，用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的成品試劑盒有API、MIS等，以及廣東環(huán)凱公司生產(chǎn)的顯色培養(yǎng)基PEN-CF[7]試劑盒。

3 分子生物學(xué)方法

自然界中每一物種都有獨(dú)一無(wú)二的DNA或RNA核酸結(jié)構(gòu)序列，隨著生命科學(xué)和分子生物科學(xué)研究的不斷發(fā)展，一些菌的核酸序列不斷被發(fā)現(xiàn)，并作為檢測(cè)目標(biāo)，形成了靈敏度高、檢測(cè)限低、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。

3.1 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是利用核酸序列，用已知DNA或RNA片段作探針與這些特異核酸序列發(fā)生結(jié)合，識(shí)別標(biāo)記，然后根據(jù)核酸分子間堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過(guò)原位、斑點(diǎn)雜交檢測(cè)核酸序列的同源情況。核酸探針技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，但其檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等問(wèn)題。陳彬等[8]用熒光素去標(biāo)記金黃色葡萄球菌特異DNA探針，然后與經(jīng)過(guò)增菌處理的金黃色葡萄球菌rRNA雜交，生成RNA和DNA雜交鏈。在450 nm處用熒光儀讀其吸收峰，當(dāng)峰面積超過(guò)其臨界數(shù)值，說(shuō)明有金黃色葡萄球菌存在；薛力剛等[9]用吖啶酯特異DNA探針檢測(cè)金黃色葡萄球菌，此法準(zhǔn)確性高；高正琴等[10]利用耐熱核酸酶核酸探針技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，與核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)比，結(jié)果相符率達(dá)100%。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)英文縮寫為PCR，是無(wú)細(xì)胞的克隆技術(shù)，或是特異性DNA體外酶促擴(kuò)增技術(shù)[11]。該方法可對(duì)DNA序列進(jìn)行分析，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，設(shè)備昂貴。Khan等[12]通過(guò)PCR法檢測(cè)牛奶中的金黃色葡萄球菌，檢出率以及靈敏度都達(dá)到100%。田靜等[13]利用PCR法檢測(cè)牛奶、肉、冰淇淋等食品中的金黃色葡萄球菌，檢出限高達(dá)10 CFU/g。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，英文縮寫為L(zhǎng)AMP。此法是利用4 種特異性引物識(shí)別目標(biāo)基因的特定區(qū)域，在BstDNA聚合酶作用下，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，30～60 min后目標(biāo)基因數(shù)量能達(dá)到109～1010個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)目標(biāo)基因的目的。周義正等[14]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的金黃色葡萄球菌，其檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果一致。

4 免疫學(xué)方法

利用特異性標(biāo)記物如酶、放射性同位素、熒光物質(zhì)等標(biāo)記抗原和抗體，通過(guò)這些標(biāo)記的抗原、抗體與抗原抗體特異性物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，檢測(cè)這些標(biāo)記物的含量而達(dá)到定性和定量檢測(cè)。

4.1 免疫磁性微球技術(shù)

免疫磁性微球技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短、精度較高，但成本較高。Yazdankhah等[15]利用酶聯(lián)免疫吸附和免疫磁性分離相結(jié)合的方式檢測(cè)牛奶中的金黃色葡萄球菌。劉琳琳[16]制備金屬螯合免疫磁性微球，用于分離金黃色葡萄球菌的SPA蛋白，進(jìn)行免疫印記分析檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

4.2 酶聯(lián)免疫技術(shù)

酶聯(lián)免疫技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，但所用的抗原、抗體以及酶標(biāo)記物等生物制劑穩(wěn)定性差，不能同時(shí)對(duì)多種組分進(jìn)行檢測(cè)。段鴻斌[17]利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的B型腸毒素。陳靖等[18]用此法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的腸毒素，檢測(cè)結(jié)果與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法一致。目前，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)主要應(yīng)用在金黃色葡萄球菌所分泌的腸毒素的檢測(cè)。

4.3 乳膠凝集技術(shù)

乳膠凝集技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且成本較低，然而致敏的乳膠會(huì)因存儲(chǔ)條件的不利產(chǎn)生自凝，使靈敏度降低，鮑行豪等[19]采用了反向間接血凝技術(shù)，通過(guò)反向被動(dòng)使乳膠凝集，由此檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素。

4.4 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)操作方便、簡(jiǎn)單且靈敏，但檢測(cè)熒光設(shè)備昂貴。朱廣發(fā)等[20]采用熒光抗體技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測(cè)。Khan等[21]將免疫熒光技術(shù)與酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素。

5 生物傳感器技術(shù)

將生物分子作為生物傳感器的敏感元件，把生物代謝生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)、物理、熱、光信號(hào)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號(hào)[22]，并將電信號(hào)放大，間接檢測(cè)目標(biāo)物。朱文杰等[23]利用多通道串聯(lián)式壓電傳感器對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)。

6 計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)

綜合人工智能、生物學(xué)、物理學(xué)、圖像處理、計(jì)算機(jī)等技術(shù)，通過(guò)圖像采集分析儀器采集生物圖像，通過(guò)計(jì)算機(jī)以及相關(guān)程序分析處理圖像。計(jì)算機(jī)視覺檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本較低、準(zhǔn)確率高、處理速度快、靈敏度高。

7 結(jié)論

隨著人們對(duì)乳制品安全需求的提高，常規(guī)的檢測(cè)方法已不能滿足目前社會(huì)快速發(fā)展的需求，開發(fā)方便、快捷、操作簡(jiǎn)便，成本相對(duì)較低的檢測(cè)方法是未來(lái)食品安全檢測(cè)的發(fā)展方向。

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孔祥瑞（1982-），女，本科，研究方向?yàn)槿橹破窓z測(cè)化驗(yàn)。

2017-06-20）