侯瑾，李迎秋

(齊魯工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

侯瑾，李迎秋*

(齊魯工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有方法簡捷、檢測成本低、分析容量大等優(yōu)點(diǎn)，適合于復(fù)雜基質(zhì)中的微量成分分析，受到越來越多人的青睞。簡單概述了ELISA技術(shù)，并從農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、違禁添加物、病原微生物和生物毒素以及轉(zhuǎn)基因食品安全性等方面，對該技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的介紹，提出了ELISA技術(shù)存在的問題和相應(yīng)的解決方法，并對該技術(shù)進(jìn)行了展望。

酶聯(lián)免疫吸附;原理;食品安全檢測;應(yīng)用

酶聯(lián)免疫吸附法(簡稱ELISA)是將現(xiàn)代檢測手段與免疫技術(shù)相結(jié)合建立的具有高敏感性和特異性的一種超微量的實(shí)驗(yàn)檢測技術(shù)，它是一種以免疫酶為核心且用特殊試劑分析的免疫檢測方法。最初，ELISA主要用于檢測病毒和細(xì)菌，20世紀(jì)70年代末，ELISA用于抗原和抗體的檢測。由于研制出各種類型的抗原、抗體復(fù)合物及高純度抗體，使單克隆抗體技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用并推進(jìn)了免疫分析法的發(fā)展和應(yīng)用[1]，ELISA技術(shù)隨著自動(dòng)化免疫技術(shù)的發(fā)展大大提高了定量分析能力和準(zhǔn)確性，彌補(bǔ)了儀器法和化學(xué)法方面的局限性，在眾多的學(xué)科領(lǐng)域有著較高的應(yīng)用價(jià)值，ELISA技術(shù)對食品中殘留物、污染物的分析已成為世界各國學(xué)術(shù)研究的新熱點(diǎn)。

1 酶聯(lián)免疫吸附法的概述

1.1 基本原理

酶聯(lián)免疫吸附法(簡稱ELISA)以免疫學(xué)為基礎(chǔ)將酶與抗原抗體結(jié)合成仍有免疫活性的免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合物再與抗原和抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)[2]，結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間，使這種反應(yīng)具有高度的特異性。酶結(jié)合在免疫復(fù)合物上，可催化相應(yīng)的底物生成發(fā)光或熒光呈色的產(chǎn)物，可以將免疫效果放大到極致，選擇合適的方法和配套的自動(dòng)化酶標(biāo)儀進(jìn)行定性、定量的測定。ELISA法檢測結(jié)果的精確性是以試劑符合要求和標(biāo)準(zhǔn)化操作為前提。由于酶有著很高的催化頻率，可以使反應(yīng)效率很明顯，因此這種測定方法的靈敏度很高。

1.2 類型和形式

根據(jù)不同的分析原理可分為均相(或異相)免疫分析和非均相分析，均相免疫分析是指抗原抗體在同一介質(zhì)中進(jìn)行的免疫反應(yīng)，不需要磁性微球等固相載體，它分為間接法、競爭法、雙抗夾心法和捕獲法。

間接法是常用的抗體檢測方法，該方法是將其轉(zhuǎn)化的抗原用于同一酶標(biāo)抗體的檢測，以檢測各種抗體，所以不針對每一種抗原或抗體的特異性進(jìn)行標(biāo)記抗體，大大簡化了實(shí)驗(yàn)；競爭法能夠測定抗原和抗體，是利用待測抗原和酶標(biāo)抗原與特異性抗體(或抗原)競爭結(jié)合而進(jìn)行測定的一種方法；雙抗體夾心法不需要直接標(biāo)記特異性抗體，但制備酶標(biāo)記物和純化免疫球蛋白需要較強(qiáng)的技術(shù)能力，成本高，操作步驟復(fù)雜；捕獲法主要用于測定IgM類抗體的量。此外，還有多種模式的方法如抗原直接包被法、雙夾心法、競爭性抑制法和抗酶標(biāo)法等，采用哪種方式依檢測目的而定。

酶聯(lián)免疫吸附分析的形式有三種：固相酶聯(lián)免疫吸附分析方式，是基于固相載體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，固相載體的形狀主要為磁珠、試管和微孔板三種；而板式酶聯(lián)免疫吸附分析法是較常用的形式；試紙條免疫吸附分析法，屬于定性檢測技術(shù)，與試劑盒相比具有更易于攜帶、檢測等優(yōu)點(diǎn)；管式酶聯(lián)免疫吸附法，可增加反應(yīng)的體積，提高實(shí)驗(yàn)靈敏度，并可作為一種比色杯，直接放在分光光度計(jì)中檢測。

2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

2.1 農(nóng)藥殘留的檢測

農(nóng)藥殘留是在動(dòng)物、植物或其相關(guān)環(huán)境中使用或曾經(jīng)使用農(nóng)藥而儲(chǔ)存、蓄積在細(xì)胞、組織或動(dòng)物體內(nèi)的農(nóng)藥原型、代謝產(chǎn)物和相關(guān)的雜質(zhì)。近年來，大量使用農(nóng)藥，導(dǎo)致糧食作物中農(nóng)藥殘留量過大，呈上升趨勢，農(nóng)藥殘留已成為我國食品安全的重要問題之一，農(nóng)藥殘留傳統(tǒng)檢測法成本高，對實(shí)驗(yàn)要求相當(dāng)高，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而ELISA法操作簡便，能快速檢測大批樣品，已成為許多國家檢測農(nóng)藥殘留的首要方法。發(fā)達(dá)國家從20世紀(jì)90年代初期就已開始進(jìn)行殘留控制，建立起國家殘留檢測體系，并已研發(fā)出快速檢測分析農(nóng)殘量的商品試劑盒，同樣我國也加快了研究酶聯(lián)免疫法快速檢測農(nóng)藥殘留的步伐，檢測范圍可精確到ng和pg水平。

ELISA技術(shù)廣泛應(yīng)用在氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機(jī)氯、有機(jī)磷類等農(nóng)藥殘留檢測上。a.氨基甲酸酯類農(nóng)藥使用較多，Katsoudas E等[3]用ELISA法檢測出新鮮水果中胺甲萘和蟲螨威的檢測限為2.0×10-6和8.0×10-6。b.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥屬于人工合成的神經(jīng)毒劑，文孟棠[4]以間苯氧基苯甲酸(PBA)為半抗原，用三種方法制備了三種包被抗原，采用ELISA法對大白菜里的PBA半定量檢測抑制中濃度(IC50)為208.93 ng/mL，最低檢測限為21.23 ng/mL。c.有機(jī)氯農(nóng)藥，在自然界中可穩(wěn)定存在，Skerritt等[5]用ELISA法測定不同基質(zhì)對植物性食物中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的影響。Lisa等[6]采用ELISA法檢測了用納米金標(biāo)記DDT抗體范圍為0.7～1000 ng/mL，且研發(fā)出浸蘸式競爭酶聯(lián)免疫快速檢測技術(shù)。d.有機(jī)磷(OPs)屬第二代農(nóng)藥。華修德[7]合成了硫代磷酸酯半抗原做單克隆抗體，用ELISA方法檢測8種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留IC50值范圍為1.4～92.1 ng/L。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)已成為一種不可或缺的農(nóng)藥殘留檢測的常規(guī)手段，可準(zhǔn)確地檢測農(nóng)藥殘留量，以確保我們的食品安全。

2.2 動(dòng)物中獸藥殘留的檢測

獸藥殘留是指在動(dòng)物及其產(chǎn)品中，如肉類、牛奶、雞蛋等藥物積累或保留的原型藥物或其代謝物，包括獸藥殘留的相關(guān)雜質(zhì)。獸藥殘留問題日益嚴(yán)重，當(dāng)人體食用量蓄積到一定程度后會(huì)引起中毒反應(yīng)。隨著酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的發(fā)展，在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用較普遍，尤其是畜肉類、水產(chǎn)品、家禽類殘留的檢測，包括抗生素、呋喃類、激素類藥物、驅(qū)蟲藥類；張弛等[8]采用活化酯法，合成具有2-甲基-5-硝基咪唑通用結(jié)構(gòu)的半抗原制備相應(yīng)通用結(jié)構(gòu)抗體，采用ELISA法檢測出不同動(dòng)物源性食品里的加標(biāo)回收率范圍為85.65%～108.65%，檢測限達(dá)1.9×10-4mg/L。崔廷婷等[9]用間接競爭ELISA法檢測出動(dòng)物源性食品里紅霉素殘留樣品回收率范圍為69.0%～107.5%。ELISA法檢測結(jié)果快捷方便，精確高效。

2.3 食品中違禁添加物的檢測

鹽酸克侖特羅，俗稱“瘦肉精”，是一種人工合成的β-興奮劑。“瘦肉精事件”曝光后，這個(gè)名詞才被大家所熟知，瘦肉精能被家畜和人體很好地吸收，提高家畜的瘦肉率，生物利用度較高，但對人體的危害較大，會(huì)使人出現(xiàn)頭暈、肌肉震顫、心悸和四肢麻木等中毒現(xiàn)象，最終會(huì)引起畸變和癌變[10]。孫明君等[11]用間接競爭ELISA法檢測進(jìn)出口動(dòng)物中“瘦肉精”最低檢測限達(dá)0.05 ng/mL，與其他激素存在交叉反應(yīng)。

三聚氰胺[C3N3(NH2)3]，分子式含氮量比蛋白質(zhì)高出30%，在食品中摻入少量便能大大提高用凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)含量[12]，王旻子等[13]制備抗三聚氰胺單克隆抗體得到兩種雜交瘤細(xì)胞，采用間接競爭ELISA 法檢測這兩種細(xì)胞的IC50值分別為8.0，8.3 ng/mL，無交叉反應(yīng)。因此ELISA法檢測三聚氰胺準(zhǔn)確、敏感、快速，適合三聚氰胺快速檢測的推廣應(yīng)用。

罌粟堿(1-[ (3,4-二甲氧基苯基)甲基]-6,7-二甲氧基異喹啉)是罌粟中存在的一種重要的生物堿[14]，可治療疾病，但長期服用使人對其產(chǎn)生依賴性。危害人體健康。Pictet和Gams在1909 年提出了罌粟堿的人工合成方法[15]。宋家銓等[16]根據(jù)固相酶聯(lián)免疫吸附原理，采用競爭ELISA法檢測食品中罌粟堿，準(zhǔn)確度高(可檢出0.1 μg/kg)。目前，酶聯(lián)免疫法是檢測食品中非法添加罌粟殼的主要方法。

2.4 食物中病原微生物的應(yīng)用

病原微生物污染引起的食品安全問題也日益嚴(yán)重，常規(guī)的培養(yǎng)法有很多的不足，試劑多，周期較長，而酶聯(lián)免疫法能夠彌補(bǔ)這些缺陷。ELISA可快速、方便地檢測食品中含有的大腸桿菌157、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病微生物。大多是通過制備單克隆抗體及ELISA法對食品中的病原微生物進(jìn)行分析、檢測，結(jié)果可靠且準(zhǔn)確。其中沙門氏菌的研究較多，它是細(xì)菌性食物中毒的重要致病菌，且作為致病菌檢測的一項(xiàng)重要指標(biāo)[17]。伍燕華等[18]用雙抗夾心ELISA方法快速檢測出多種典型沙門氏菌培養(yǎng)液中最低檢測量為1×104cfu/mL，與其他雜菌無交叉反應(yīng)。Yazdankhah[19]采用酶聯(lián)免疫吸附和免疫磁性分離兩種結(jié)合方法檢測出在3 h內(nèi)牛奶里金黃色葡萄球菌的最低檢測限為105cfu/mL。用ELISA法檢測病原微生物省時(shí)省力且效果精準(zhǔn)。

2.5 在生物毒素中的測定

生物毒素是由生物(植物、動(dòng)物、微生物和海洋生物)產(chǎn)生且對其他生物產(chǎn)生毒害作用的不可復(fù)制的生物源化學(xué)物質(zhì)[20]。生物毒素通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康，由生物毒素導(dǎo)致的食品安全問題不容忽視?，F(xiàn)在，對幾乎所有的真菌毒素均建立了ELISA檢測法。管笛等[21]用ELISA法檢測玉米中的黃曲霉毒素B1過程中用磁微粒代替酶標(biāo)板作為固定相，以單克隆抗體為基礎(chǔ)建立了兩類方法，分別是引入2.8 μm磁微粒的間接競爭法以及引入2.8 μm粒徑羧基磁微粒的直接競爭法，較常規(guī)ELISA法檢測限低4.3～5倍。歐小蕾[22]以制備麻痹性貝類毒素膝溝藻毒素2，3(GTX2，3)單克隆抗體，用間接競爭ELISA快速檢測出GTX2，3的效價(jià)達(dá)到1∶51200，檢測結(jié)果快速、精準(zhǔn)。

近年來，我國研究了多種用于分析毒素的ELISA診斷試劑盒，李平等[23]用ELISA試劑盒檢測出四類乳制品里黃曲霉毒素M1最低檢測限分別為0.039,0.192,0.306,0.199 μg/kg(L)，回收率都超過93%。蒙君麗等[24]用3個(gè)不同廠家的ELISA試劑盒檢測生鮮乳中黃曲霉毒素M1殘留量，得出試劑盒的回收率在93.5%～103.5%。通過分析對比可知，不同廠家的試劑盒測定結(jié)果精確度、準(zhǔn)確性都較好。ELISA技術(shù)在生物毒素檢測方面雖取得了一定的進(jìn)展，但由于缺乏毒素標(biāo)準(zhǔn)，抗體大多只是針對某種毒素建立，對其他毒素常表現(xiàn)出較低的交叉反應(yīng)，要實(shí)現(xiàn)ELISA技術(shù)在生物毒素上的深入研究仍需要一定的努力。

2.6 轉(zhuǎn)基因食品的檢測

轉(zhuǎn)基因食品現(xiàn)已成為當(dāng)今發(fā)展最快的新型食品，轉(zhuǎn)基因食品的安全是伴隨著轉(zhuǎn)基因食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展而興起的一門新興學(xué)科，公眾對轉(zhuǎn)基因食品安全性和風(fēng)險(xiǎn)性的關(guān)注正越來越大。有些發(fā)達(dá)國家已實(shí)行強(qiáng)制性轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識，賦予消費(fèi)者知情權(quán)[25]。轉(zhuǎn)基因食品的食用安全性從過敏原、毒性、營養(yǎng)成分、標(biāo)記基因方面來進(jìn)行評價(jià)，目前，ELISA法是檢測轉(zhuǎn)基因目的蛋白的較常用的方法，主要用于原料和半成品的快速定性分析[26]，成功解決了檢測轉(zhuǎn)基因食品中核酸制備難的問題。張留圈[27]以磁珠液相及雙抗夾心ELISA法檢測出Bt中Cry1Ac蛋白毒素的檢出限為0.91 ng/mL。劉志浩等[28]用雙抗體夾心ELISA法檢測出轉(zhuǎn)基因玉米中膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)最低檢測限為2.68 ng/mL，檢測范圍為3.125～50 ng/mL，ELISA法的再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性較好。

目前市場上有許多常見的轉(zhuǎn)基因蛋白安全的ELISA試劑盒。我國現(xiàn)已研制出Bt 9玉米粉中tarlinkCry9C蛋白的ELISA檢測試劑盒。顧煒煒等[29]成功研制出用直接競爭ELISA試劑盒檢測出轉(zhuǎn)基因食品中Btcry2Ab/2Ac殺蟲蛋白的線性檢測范圍為40～2000 ng/mL，最低檢測限是40 ng/mL，ELISA試劑盒大大簡化了整個(gè)操作流程。

ELISA法實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)中大批樣品的快速檢測。但轉(zhuǎn)基因食品中可能將基因供體轉(zhuǎn)移到植物或者動(dòng)物受體中[30]，會(huì)引發(fā)一些人體的過敏反應(yīng)。目前已研究出了雞蛋過敏蛋白、花生過敏原蛋白和β-乳球蛋白過敏原的夾心ELISA方法。

2.7 食品中其他成分的檢測

ELISA還可檢測食品中其他成分的含量變化。a.重金屬[31]、抗生素殘留[32]及營養(yǎng)因子的測定[33]。b.食品加工過程中酶(如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和β-內(nèi)酰胺酶)含量變化的測定[34]。c.測定保健食品中透明質(zhì)酸[35]及乳制品中乳酸鏈球菌素的含量[36]。d.食品中各種蛋白質(zhì)如IL2-HSA融合蛋白和燕窩中唾液酸糖蛋白的含量測定[37]。e.采用ELISA技術(shù)檢測植物中微量的雌激素，需先合成不同的異黃酮的羥酸半抗原。

3 ELISA在食品安全檢測中的局限性和應(yīng)用展望

ELISA技術(shù)具有簡便易操作，沒有同位素及放射性污染，試劑可長時(shí)間保存等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也有一定的局限性，ELISA法檢測結(jié)果會(huì)受到一些其他不明因子的干擾，不可避免地出現(xiàn)定性假陽性與假陰性。ELISA法難于分析檢測不穩(wěn)定的化合物和分子量較小的化合物，并且不能進(jìn)行多殘留檢測，使用ELISA技術(shù)同時(shí)分析檢測多種成分時(shí)較困難。

隨著用于檢測食品安全的ELISA試劑盒不斷涌現(xiàn)，加快了ELISA試劑盒商業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，使ELISA技術(shù)有更明顯的優(yōu)勢，使越來越多的學(xué)者研究改良和完善這種技術(shù)的方法，可加快ELISA檢測中多項(xiàng)標(biāo)記快速測定及高度免疫原性重組抗原的研究進(jìn)程。要實(shí)現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)完全替代傳統(tǒng)技術(shù)，我們需準(zhǔn)備大量的工作，可以與其他傳統(tǒng)檢測方法結(jié)合使用(如HPLC，GC/MS，PCR)，能彌補(bǔ)一些局限性，提高檢測結(jié)果的重現(xiàn)性和精準(zhǔn)性。

相信在不久的將來能夠?qū)崿F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室用ELISA法分析檢測近百種食品成分?？梢源_定，ELISA法在食品安全檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Application of Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay in Food Safety Testing

HOU Jin, LI Ying-qiu*

(College of Food Science and Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353， China)

Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) is a simple method with advantages of low detection cost and large analysis capacity, etc..It is suitable for trace analysis of components in complex matrices and it attracts more and more people. Outline the ELISA technology briefly. The application of this technology in food safety testing is introduced detailedly from aspects of pesticide residues, veterinary drug residues, illegal additives, pathogenic microorganisms, biological toxins as well as the safety of genetically modified food and other aspects. Furthermore, mention the technical problems and corresponding solutions of ELISA, and prospect the technology in the future.

enzyme-linked immuno sorbent；principle；food safety testing；application

2017-01-10 *通訊作者

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371839)；山東省高?？茖W(xué)與技術(shù)發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(J13LE02)

侯瑾(1992-)，女，山東菏澤人，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.036

1000-9973(2017)06-0165-05