陳肖燕， 鄧春玉， 鄺素娟， 楊 慧， 饒 芳， 單志新， 林秋雄， 姜 立△

(1汕頭大學醫(yī)學院，廣東 汕頭 515041； 2廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究部，廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080)

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毒胡蘿卜素誘導大鼠冠狀動脈平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立*

陳肖燕1, 2， 鄧春玉2， 鄺素娟2， 楊 慧2， 饒 芳2， 單志新2， 林秋雄2， 姜 立2△

(1汕頭大學醫(yī)學院，廣東 汕頭 515041；2廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究部，廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080)

目的： 探討SD大鼠冠狀動脈平滑肌細胞(coronary artery smooth muscle cells，CASMCs)原代培養(yǎng)方法，并建立CASMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)模型。方法: 用組織塊貼壁法培養(yǎng)CASMCs，光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)。免疫熒光技術(shù)檢測CASMCs的標志分子α-SMA和SM-MHC的表達。采用Western blot檢測ERS發(fā)生的標志物BiP和CHOP的蛋白表達水平。結(jié)果: 冠狀動脈組織塊貼壁培養(yǎng)6 d后，細胞從組織塊邊緣爬出，呈長梭型，9～10 d細胞生長匯合后表現(xiàn)出平滑肌細胞典型的“峰-谷”狀。免疫熒光技術(shù)鑒定結(jié)果顯示，α-SMA和SM-MHC表達呈陽性。不同濃度(0.5、1和2 μmol/L)的毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)處理CASMCs 24 h后，Western blot結(jié)果顯示，TG(1和2 μmol/L)處理組的BiP和CHOP蛋白表達與對照組相比增加，差異具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比較，1 μmol/L TG處理CASMCs 24和48 h后BiP和CHOP蛋白表達顯著性增加。結(jié)論: 采用組織塊貼壁法可以成功培養(yǎng)CASMCs。利用1 μmol/L TG誘導24 h可建立CASMCs 的ERS模型。

冠狀動脈平滑肌細胞； 組織塊貼壁法； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞重要的細胞器之一，其穩(wěn)定性是保障內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件，但是一些病理因素可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂、缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、缺氧、酸中毒、高同型半胱氨酸、卵磷脂合成障礙等[1]。ERS是指由于上述原因引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂、錯誤蛋白或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集的一種亞細胞器病理狀態(tài)。ERS可使細胞產(chǎn)生未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)定。但如果ERS過強或持續(xù)時間過長，超過細胞自身調(diào)節(jié)能力可誘發(fā)細胞凋亡，進而導致一系列病理反應(yīng)[2-3]。發(fā)生ERS的細胞能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性促凋亡分子[如C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和caspase-12等]，以及促存活分子[如生長阻滯及DNA損傷誘導蛋白34(growth arrest and DNA-damage-inducible protein 34，GADD34)和免疫球蛋白結(jié)合蛋白(binding immunoglobulin protein，BiP)等]的表達活化，最終決定細胞是適應(yīng)ERS還是凋亡[4]。目前，ERS的這種雙向應(yīng)答方式成為了治療心血管疾病和癌癥的潛在靶點[5-8]。

研究表明，冠狀動脈平滑肌細胞(coronary artery smooth muscle cells，CASMCs)發(fā)生ERS與冠狀動脈粥樣硬化和血管鈣化等病理變化密切相關(guān)[9-12]，但其具體機制尚未闡明。本研究旨在培養(yǎng)原代CASMCs，并在細胞水平構(gòu)建CASMCs的ERS模型，為研究ERS的發(fā)生機制提供一種細胞模型。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，180～200 g，購自中山大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2011-0029。

2 主要試劑

DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco；0.25%胰蛋白酶以及Ⅰ抗稀釋液購自上海碧云天公司；抗BiP、CHOP和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；抗α-SMA和SM-MHC抗體購自Abcam；Ⅱ抗購自Invitrogen；封閉牛奶和loading buffer購自Bio-Rad；TG購自Sigma；PVDF膜購自Millipone。

3 主要方法

3.1 大鼠CASMCs的培養(yǎng) 采用頸椎脫臼法處死SD大鼠，在無菌條件下迅速取出大鼠心臟。用顯微器械在顯微鏡下分離出心臟的前降支、右冠狀動脈及間隔支，操作時動作要輕柔，避免對血管的過度損傷。將冠狀動脈剪碎至1 mm×1 mm大小塊狀放入6孔板中，加入2 mL 20%胎牛血清的1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)絕對靜置孵育3～5 d。第6天在顯微鏡下觀察細胞已從血管組織塊中爬出，在第9～10天細胞匯合成片時，用0.25%的胰酶原孔消化細胞，使細胞均勻鋪在6孔板中，每48 h換液。待細胞長滿時以1∶2進行傳代，隨后改用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

3.2 大鼠CASMCs的鑒定 采用免疫熒光技術(shù)對第4代細胞進行細胞鑒定，檢測CASMCs的標記分子α-SMA和SM-MHC的表達。將爬片置于濃硫酸中浸泡并過夜，第2天先用自來水沖洗20遍，再用三蒸水沖洗3遍，高壓消毒烘干后將玻片置于6孔培養(yǎng)板中。0.25%胰酶消化細胞后重懸細胞，計數(shù)，將3×105接種到細胞培養(yǎng)板。4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗5 min×3次，0.2% Triton X-100破膜20 min，PBS洗5 min×3次。山羊血清封閉30 min，封閉后加入α-SMA(1∶100)和SM-MHC(1∶100)的Ⅰ抗4 ℃靜置過夜。PBS洗5 min×3次, 避光加入熒光Ⅱ抗(1∶1 000)，PBS洗5 min×3次，最后加入DAPI染核5 min，封片后用熒光顯微鏡觀察。

3.3 TG誘導大鼠CASMCs 取5～6代原代CASMCs，將CASMCs均勻地接種到6孔板上，分為空白對照組(blank組)、DMSO組和TG(0.5、1和2 μmol/L)處理組，TG處理時間為24 h。此外，用1 μmol/L的TG處理CASMCs 12、24和48 h后用PBS清洗3遍，用于提取總蛋白。

3.4 Western blot檢測BiP和CHOP蛋白的表達量的變化 蛋白裂解液加入絲氨酸蛋白酶抑制劑后提取CASMCs總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白提取液用10%的SDS-PAGE進行分離，然后將電泳分離凝膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃過夜孵育BiP(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 500)Ⅰ抗。TBST洗5 min×3次，常溫孵育Ⅱ抗(1∶2 500) 1 h，TBST洗5 min×3次，最后用ECL試劑盒顯影蛋白條帶。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠CASMCs的培養(yǎng)及鑒定

冠狀動脈組織貼塊6 d，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CASMCs已從冠狀動脈邊緣中爬出，并且形狀為長梭型。9～10 d組織塊周圍的細胞相互匯合, 逐漸鋪滿瓶底時,具有CASMCs典型的“峰-谷”形狀，見圖1。免疫熒光結(jié)果提示α-SMA(紅色)和SM-MHC(綠色)染色呈陽性，說明所培養(yǎng)的細胞為CASMCs，見圖2。

Figure 1.Inverted microscopic images of the rat CASMCs (×100). A: at 7 d; B: at 9 d.

圖1 大鼠冠狀動脈血管平滑肌細胞倒置顯微鏡圖像

2 毒胡蘿卜素處理CASMCs可使BiP和CHOP蛋白表達增加

不同濃度的TG(0.5、1和2 μmol/L)處理CASMCs 24 h后，Western blot檢測結(jié)果表明，TG(1和2 μmol/L)處理組的BiP蛋白表達與對照組相比增加，差異具有統(tǒng)計學意義，0.5 μmol/L TG處理組的BiP蛋白表達與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異。TG(0.5、1和2 μmol/L)處理組的CHOP蛋白表達與對照組相比均顯著性增加，不同濃度處理組間的BiP和CHOP蛋白表達沒有統(tǒng)計學差異，見圖3、4。1 μmol/L TG處理CASMCs不同時間的結(jié)果顯示，TG(12和24 h)處理組的BiP蛋白表達與對照組相比顯著增加，TG處理12 h的BiP蛋白表達與對照組相比無顯著差異。1 μmol/L TG處理CASMCs 12、24和48 h后CHOP蛋白表達與對照組相比均顯著性增加。不同時間處理組間的BiP蛋白呈時間依賴性增加，見圖5、6。

Figure 2.Identification of CASMCs. Immunofluorescence staining of SM-MHC and α-SMA in the CASMCs (×100). The CASMCs were stained with antibodies against SM-MHC (green) and α-SMA (red). The nuclei were stained with DAPI.

圖2 大鼠冠狀動脈血管平滑肌細胞的鑒定

討 論

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及藥物誘導

ERS存在于許多疾病的發(fā)生發(fā)展進程中，如自身免疫疾病、癌癥、非酒精性脂肪肝、心臟病、動脈粥樣硬化、二型糖尿病、肥胖以及神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂[13]。因ERS常導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的蓄積，引起UPR，故一般用參與UPR的標志性分子BiP和CHOP的表達上調(diào)來提示ERS的發(fā)生[14-15]。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE-1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3條信號通路的重要感應(yīng)蛋白[1]。這3種感應(yīng)蛋白在未發(fā)生ERS時均以無活性的狀態(tài)與BiP結(jié)合，當ERS發(fā)生時BiP與上述3種蛋白分離，并使其活化，進而激活相應(yīng)的信號通路[2-3]。鈣離子代謝紊亂是ERS的重要誘發(fā)因素，細胞內(nèi)穩(wěn)定的鈣離子濃度對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶BiP十分重要[16]。TG作為鈣泵和Mg2+-ATPase的抑制劑，可以促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子向胞漿轉(zhuǎn)運，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度下降，紊亂其功能，導致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，引起ERS。在細胞培養(yǎng)和動物實驗中常被用來誘導ERS[16-17]。

2 CASMCs的培養(yǎng)及鑒定

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)位于血管中膜，是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細胞成分，其結(jié)構(gòu)及功能的改變是導致高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等多種心血管病的細胞病理學基礎(chǔ)。目前主動脈血管平滑肌細胞(aortic vascular smooth muscle cells，AVSMCs)培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)很成熟，但因冠狀動脈的分離難度較主動脈大，CASMCs的培養(yǎng)比AVSMCs困難,國內(nèi)相關(guān)報道比較少見。原代培養(yǎng)VSMCs主要有酶消化培養(yǎng)法和組織塊貼壁法2種方法。采用酶消化培養(yǎng)法所需時間短, 獲得的細胞量多。但由于酶消化法步驟繁鎖，且膠原酶價格昂貴, 實驗成本高。另外，冠狀動脈的組織量較少，不宜采用酶消化培養(yǎng)法。本研究利用組織塊貼壁法培養(yǎng)CASMCs更為簡便、經(jīng)濟、有效。SM-MHC和α-SMA是CASMCs的標記分子，可用來鑒定原代CASMCs。經(jīng)過免疫熒光鑒定DAPI所染細胞核與SM-MHC和α-SMA所染細胞骨架重合，結(jié)果為陽性，表明所培養(yǎng)出的細胞是CASMCs。

Figure 3.Protein expression of BiP after treatment with different doses of TG. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3 不同濃度毒胡蘿卜素處理組的BiP蛋白表達量增加

Figure 4.Protein expression of CHOP after treatment with diffe-rent doses of TG. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖4 不同濃度毒胡蘿卜素處理組的CHOP蛋白表達量增加

Figure 5.Protein expression of BiP after treatment with TG for different time. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsTG (12 h) group.

圖5 毒胡蘿卜素不同時間處理組的BiP蛋白表達量增加

Figure 6.Protein expression of CHOP after treatment with TG for different time. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖6 毒胡蘿卜素不同時間處理組的CHOP蛋白表達量增加

3 ERS模型的構(gòu)建

CASMCs 的ERS模型可用于研究ERS相應(yīng)的分子機制，有助于防治心血管疾病和腫瘤治療。不同濃度TG處理CASMCs 24 h后，TG(1和2 μmol/L)處理組的BiP蛋白表達量相比對照組顯著增加，0.5 μmol/L TG處理組的BiP蛋白表達與對照組相比較沒有統(tǒng)計學差異，說明誘導ERS的最低有效濃度為1 μmol/L。1 μmol/L TG處理CASMCs不同的時間后，TG(24和48 h)處理組的BiP蛋白的表達量相比對照組顯著增加，TG處理12 h的BiP蛋白表達與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異，說明TG處理CASMCs 24 h是誘導ERS最短的有效時間。ERS發(fā)生時，通過上調(diào)BiP蛋白表達激活A(yù)TF6、PERK和IRE-1介導的3條生存信號通路來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。細胞在正常情況下CHOP蛋白的表達很低，當ERS發(fā)生時CHOP蛋白表達上調(diào)，CHOP作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)DOCs、Bcl-2和GADD34的表達來誘導細胞凋亡。

綜上所述，組織塊貼壁法培養(yǎng)CASMCs實驗方法簡單，高效，純度較高。1 μmol/L TG處理CASMCs 24 h可構(gòu)建該細胞的ERS模型，為研究ERS的發(fā)生機制提供細胞模型。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Model construction of rat coronary artery smooth muscle cell endoplasmic reticulum stress induced by thapsigargin

CHEN Xiao-yan1, 2, DENG Chun-yu2, KUANG Su-juan2, YANG Hui2, RAO Fang2, SHAN Zhi-xin2, LIN Qiu-xiong2, JIANG Li2

(1ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China;2MedicalResearchCenter,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:jiangli27556@vip.126.com)

AIM: To investigate the primary culture method for coronary artery smooth muscle cells (CASMCs), and to establish the endoplasmic reticulum stress (ERS) model in CASMCs of SD rats. METHODS: CASMCs were cultured by tissue explant method. The morphological characteristics were observed under optical microscope. The marker proteins of CASMCs, including α-SMA and SM-MHC, were identified by immunofluorescence technique. The protein expression levels of BiP and CHOP, the marker molecules of ERS, were determined by Western blot. RESULTS: The spindle-shaped CASMCs climbed out from the edge of coronary artery tissues after 6 d, and formed the typical "hill and valley" growth pattern of CASMCs at 9～10 d. The result of immunofluorescence technique showed that α-SMA and SM-MHC were positively expressed. The results of Western blot showed that the protein expression of BiP and CHOP in TG (1 and 2 μmol/L) treatment groups was increased compared with control group. Compared with control group, the protein expression of BiP and CHOP was significantly increased after 1 μmol/L TG treatment for 24 and 48 h. CONCLUSION: CASMCs can be successfully cultured by tissue explant method. ERS model of CASMCs was established by 1 μmol/L TG treatment for 24 h.

Coronary artery smooth muscle cells; Tissue explant method; Endoplasmic reticulum stress

1000- 4718(2017)01- 0128- 05

2016- 06- 27

2016- 11- 22

國家自然科學基金資助項目(No. 81273516; No. 81470440)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.021

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△通訊作者 Tel: 020-83820615; E-mail: jiangli27556@vip.126.com