韓克實 ,楊 旭,黃瑞哲△

1.西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔科(西安710077)，2.西安交通大學口腔醫(yī)院(西安710003)

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△通訊作者

成釉細胞株ALC體外培養(yǎng)觀察

韓克實1,楊 旭2,黃瑞哲2△

1.西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔科(西安710077)，2.西安交通大學口腔醫(yī)院(西安710003)

目的：探索成釉細胞株ALC的體外培養(yǎng)方法，了解ALC細胞的形態(tài)特征和生長特點。方法：對成釉細胞株ALC進行復蘇、培養(yǎng)，運用免疫細胞化學SABC法檢測角蛋白14和釉原蛋白的表達。結(jié)果：ALC細胞呈現(xiàn)特征性的“鋪路石”樣生長，多邊形，細胞間連接緊密，細胞核明顯，有短的細胞突起，符合上皮樣細胞生長特點。免疫細胞化學染色結(jié)果顯示角蛋白14和釉原蛋白染色陽性。結(jié)論：ALC細胞生長良好，并具有成釉細胞特點，是一種適合作為實驗研究對象的成釉細胞株。

釉質(zhì)的發(fā)育主要經(jīng)歷兩個階段，即成釉細胞合成、分泌細胞外基質(zhì)以及釉基質(zhì)的生物礦化。釉質(zhì)的形成由成釉細胞調(diào)控，成釉細胞合成釉質(zhì)基質(zhì)之后，胞外基質(zhì)在成釉細胞的調(diào)控下開始生物礦化。成釉細胞釉質(zhì)發(fā)育分泌階段表達的主要的釉基質(zhì)蛋白是釉原蛋白，大約占有機基質(zhì)的90%。牙齒發(fā)育完成需經(jīng)20多種細胞的分化，要將成釉細胞經(jīng)過分離、純化后，再構(gòu)建組織工程，難度較大。因此，特征性單一細胞的體外培養(yǎng)對牙齒發(fā)育的研究具有非常重要的意義。Nakata等取新生C57BL/6J小鼠的下頜磨牙牙胚進行組織培養(yǎng)，利用差別消化法分離成釉細胞后，獲得了自發(fā)性永生化的成釉細胞株，命名為ALC(Ameloblast-lineage cell)[1]。

材料與方法

1 材 料 DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone)；胎牛血清(美國GIBCO)；DMSO(美國Sigma)；Amelogenin單克隆抗體(美國Santa公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；生物素化兔抗山羊IgG(武漢博士德)。

2 細胞培養(yǎng)

2.1 ALC細胞的復蘇：迅速從液氮罐中取出細胞凍存管，立即放入37℃水浴箱中融解，不超過1 min；吸出已融解的細胞懸浮液，立即加入含有培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，輕輕吹打混勻后蓋緊瓶蓋，800r/min離心5 min；棄上清，加入6ml配好的DMEM高糖培養(yǎng)液，細胞吹打均勻后，移入培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細胞生長狀態(tài)。

2.2 ALC細胞的傳代：待ALC細胞鋪滿培養(yǎng)皿底壁80%～90%后，去除原培養(yǎng)液，4ml PBS液清洗培養(yǎng)皿底壁2次，并棄去PBS；培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶消化液3 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化4 min后倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓變亮時，加入3 ml DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化；用移液管輕輕吹打培養(yǎng)皿的底壁，使細胞從培養(yǎng)皿底壁完全脫落并成單個分布，收集細胞懸液于離心管中，蓋緊瓶蓋，封口膜封口，800r/min離心5 min，棄上清；加適量含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細胞、混合均勻，按1∶3比例進行傳代，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 細胞計數(shù)：取生長狀態(tài)良好的ALC細胞，加入胰蛋白酶消化液3ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，消化4min后倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓變亮時，加入3ml培養(yǎng)液以終止消化；用細胞計數(shù)器，記錄細胞數(shù)量后平均接種到24個培養(yǎng)皿中，按每個培養(yǎng)皿105個細胞接種； 24h后觀察細胞貼壁情況，之后每隔6 h計數(shù)一次，每次取3個培養(yǎng)皿，分別計數(shù)后，求平均值。

2.4 SABC法觀察角蛋白14和釉原蛋白的表達：取生長狀態(tài)良好的ALC細胞制成細胞爬片，滴加適當稀釋的角蛋白14抗體，4℃過夜，PBS(pH7.2～7.6)清洗，2 min×3次；滴加生物素化羊抗兔，37℃孵育 20 min，PBS(pH7.2～7.6)清洗，2 min×3次；滴加試劑SABC，37℃孵育20 min，PBS(pH7.2～7.6)清洗，5 min×4次；DAB顯色，顯微鏡下觀察，蒸餾水清洗，5 min×4次；蘇木素染液復染60秒；加入梯度酒精中脫水，70%(1次，1 min)-80%(1次，1 min)-90%(1次，1 min)-無水乙醇(2次×3 min)；加入二甲苯透明，2次×1min；中性樹膠封片；顯微鏡下觀察細胞胞漿的顏色。陰性對照用PBS代替一抗進行染色，其余步驟不變。釉原蛋白免疫組化步驟同角蛋白14。

結(jié) 果

1 ALC細胞的培養(yǎng)狀況 倒置顯微鏡下觀察， ALC細胞呈特征性的“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)，卵圓形或多邊形，成簇排列，細胞間連接緊密，符合上皮樣細胞生長形態(tài)(見圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下ALC細胞的形態(tài)

2 ALC細胞的生長特點 ALC細胞生長較快，貼壁后很快進入對數(shù)生長期，約24 h后進入生長穩(wěn)定期，細胞數(shù)量變化不大。生長狀態(tài)良好的ALC細胞在貼壁生長48h后，細胞密度可達到90%。

3 角蛋白14和釉原蛋白免疫組化染色結(jié)果 ALC細胞呈不規(guī)則多邊形，胞體豐滿，細胞漿豐富，胞核圓形居中，角蛋白14和釉原蛋白陽性染色細胞胞漿中可見棕黃色染色(見圖2A，圖3A)，陰性對照細胞胞漿中無棕黃色染色(見圖2B，圖3B)，說明ALC細胞表達角蛋白14和釉原蛋白。

A為陽性，B為陰性

A為陽性，B為陰性

討 論

最初研究牙源性上皮的結(jié)構(gòu)和功能，是通過體外培養(yǎng)牙胚的方法來獲得的，后又將其從牙胚中分離出來單獨研究[2]。但這些方法獲得的細胞培養(yǎng)時間短，也難以單因素分析牙源性上皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能。于是，有學者開始進行成釉細胞的體外分離培養(yǎng)研究[3]。

Chen等人分離小鼠第一磨牙的成釉器上皮細胞，采用組織消化法，培養(yǎng)出原代的上皮樣細胞，將含SV40大T抗原的質(zhì)粒導入上皮樣細胞中，從而獲得的永生化細胞株命名為LS8，具有成釉細胞特性，如表達角蛋白和釉原蛋白等，屬于分泌期成釉細胞。DenBesten等人分離幼豬未萌磨牙的成釉器上皮細胞，通過磷酸鈣沉淀法將含多瘤病毒大T-抗原編碼基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上述細胞中，所建立的成釉細胞樣細胞系命名為PABSo-E，此細胞系保留成釉細胞的某些特性，如表達釉原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶20、釉基質(zhì)絲氨酸蛋白酶1等。Kawano等人建立了口腔上皮細胞系HAT-7，免疫組織化學表明，HAT-7表達釉原蛋白，成釉蛋白，堿性磷酸酶(ALP)，具有成釉細胞特性[4]。Nakata等人取新生C57BL/6J小鼠的下頜磨牙牙胚進行組織培養(yǎng)，利用差別消化法分離成釉細胞后，獲得了自發(fā)性永生化的成釉細胞株，命名為ALC(Ameloblast-lineage cell)。ALC細胞具備成釉細胞的特性，包括體外培養(yǎng)時能夠表達成釉細胞特異性蛋白(釉原蛋白，釉叢蛋白和成釉蛋白)，以及在體外誘導生物礦化的能力[5]。

本實驗所培養(yǎng)的ALC細胞為卵圓形或多邊形，采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，細胞增殖能力較強，生長較快，穩(wěn)定單一，形態(tài)良好。鑒定ALC 細胞時，選擇了上皮樣細胞的特異性蛋白-角蛋白14和成釉細胞的特異性蛋白-釉原蛋白[6-7]，ALC細胞在體外培養(yǎng)過程中穩(wěn)定地表達角蛋白14和釉原蛋白，可認為ALC細胞為成釉細胞。ALC細胞既突破了原代細胞培養(yǎng)的限制，又避免了因外源基因的導入而導致成釉細胞某些重要生物學特性的改變。它們細胞均一，生長穩(wěn)定，并擁有成釉細胞的各種特性，是一種適合作為實驗研究對象的細胞株。

[1] Nakata A, Kameda T, Nagai H,etal. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2003, 308 (4): 834-839.

[2] 王冠宇.成釉細胞的培養(yǎng)及其在釉質(zhì)形成中的作用[J].醫(yī)學綜述, 2007, 13 (24): 1952-1954.

[3] 張 軍,李曦光.人胚成釉細胞體外培養(yǎng)的實驗研究[J].臨床口腔醫(yī)學雜志,2004,20 (4): 201-203.

[4] Kawano S, Morotomi T, Toyono T,etal. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway[J]. Journal of Geophysical Research Solid Earth,2002, 43 (2-3): 50-57.

[5] 馬 林,張 穎,張凱強，等.不同濃度氟化物對體外培養(yǎng)成釉細胞活性的影響[J].口腔醫(yī)學,2013,33(10):649-651.

[6] 田 華,呂 平,高 巖，等.鐘狀期成釉細胞的體外生長研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志, 2009,19(6):309-313.

[7] 包柳郁,金 巖,牛忠英，等.人牙源性上皮細胞的體外培養(yǎng)研究[J].臨床口腔醫(yī)學雜志, 2003,19(11):643-645.

(收稿：2016-06-28)

成釉質(zhì)細胞 細胞培養(yǎng) 體外發(fā)生 @釉原蛋白

R783.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.01.004