李東繁，杜旭升，劉 安

西安市中心醫(yī)院呼吸科(西安 710003)

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·基礎(chǔ)研究·

PM2.5對(duì)大鼠氣管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及自噬的影響*

李東繁，杜旭升，劉 安

西安市中心醫(yī)院呼吸科(西安 710003)

目的：探討PM2.5對(duì)RTE大鼠氣管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激及自噬的影響。方法：采集制備不同濃度的PM2.5來(lái)處理RTE細(xì)胞，用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增值率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)(ROS)自由基生成，Western Blot檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 I蛋白(LC3I)和LC3II表達(dá)。結(jié)果：PM2.5100 mg/L和200 mg/L處理后細(xì)胞存活率均明顯降低，并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。不同濃度PM2.5可升高胞內(nèi)ROS水平及增加LC3 II蛋白表達(dá)，亦呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)論：PM2.5通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)激及自噬對(duì)氣道上皮起到損害作用，其中氧化應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度自噬的發(fā)生。

近年來(lái)，以慢性阻塞性肺疾病為代表的呼吸系統(tǒng)疾病患病率和病死率居高不下，在危害人類(lèi)健康的同時(shí)給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。吸煙及空氣污染是其主要的病因[1]。PM2.5做為環(huán)境監(jiān)測(cè)指標(biāo)已被大家熟悉，因其顆粒微小，可沉積于下呼吸道，故也稱(chēng)為可吸入肺顆粒物。雖然其在大氣中所占比例較小，但由于其具有顆粒小、毒性大、傳播遠(yuǎn)及空氣中漂浮時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，因而對(duì)人體健康和大氣環(huán)境質(zhì)量的危害較大顆粒物更大[2]。研究表明：香煙煙霧對(duì)呼吸系統(tǒng)損害與其誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激及自噬有關(guān)[3]，但有關(guān)PM2.5誘導(dǎo)呼吸系統(tǒng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬的相關(guān)研究罕有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬從體外途徑研究PM2.5對(duì)氣管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及自噬的影響，探討PM2.5對(duì)人體呼吸系統(tǒng)負(fù)面效應(yīng)的具體機(jī)制，為進(jìn)一步研究防治PM2.5危害奠定一定的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 RTE細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；磷酸酶抑制劑、PMSF 、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司、胰酶(Trypsin-EDTA) 購(gòu)自Invitrogen公司，TEMED、SDS上樣緩沖液購(gòu)自Amresco公司；小鼠抗β-actin、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司； MTT和兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白l輕鏈3(LC3)抗體購(gòu)自Sigma公司；兔抗LC3B購(gòu)自Cell signaling。

2 研究方法

2.1 PM2.5的采集和制備：參照文獻(xiàn)[4]中的方法,采用PM2.5-2型中流量大氣顆粒物采樣器于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)樓頂每天24 h連續(xù)采集PM2.5。

2.2 MTT法檢測(cè)RTE細(xì)胞增殖：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RTE細(xì)胞，用MEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到2×105/ml，接入96孔板，每孔100μl細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白組， 37℃培養(yǎng)過(guò)夜(在細(xì)胞孔周?chē)變?nèi)加入100 μl無(wú)菌PBS)； 根據(jù)如下分組分別處理細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24 h。PM2.5處理時(shí)間：24、48 h；PM2.5處理濃度：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L。每孔加入10μl MTT，37℃培養(yǎng)4h；吸出培養(yǎng)基，加入150μl DMSO震蕩10min；酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值OD。

2.3 流式檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RTE細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞均勻的接種到6孔板中，37℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜。37℃培養(yǎng)3 h，PM2.5處理濃度：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集，1500r/min，5min離心，去上清，加PBS重懸；用PBS將細(xì)胞潤(rùn)洗2次，1500r/min，5 min，使用DCFH-DA細(xì)胞ROS檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，最后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

2.4 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅰ和LC3Ⅱ表達(dá)：將RTE細(xì)胞均勻接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，并暴露PM2.5以下濃度：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L 24 h，參照文獻(xiàn)[5 ]，將RTE細(xì)胞暴露于PM2.5100 mg/L,分別在暴露0，12，24和48 h收集PM2.5處理的細(xì)胞標(biāo)本，用Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)水平。X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。沖洗晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值，以LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ條帶積分吸光度比值表示細(xì)胞自噬水平。

結(jié) 果

1 PM2.5對(duì)RTE細(xì)胞存活率的影響 PM2.5濃度50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L處理RTE細(xì)胞24 h和48 h后，可見(jiàn)細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)，且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，PM2.5200 mg/L處理48h細(xì)胞存活率最低(P<0.05)。PM2.525 mg/L 處理24 h，雖然細(xì)胞存活率有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在48 h時(shí)存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 PM2.5誘導(dǎo)RTE細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成 PM2.5濃度25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L處理RTE細(xì)胞3 h后，可見(jiàn)胞內(nèi)ROS均有所增加(P<0.05)，且呈濃度依賴(lài)性，200 mg/L時(shí)ROS生成量最大。

3 PM2.5增加細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) PM2.5濃度0，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L處理RTE細(xì)胞48 h后，LC3II/LC3I條帶積分吸光度比值明顯升高，且具濃度依賴(lài)性(P<0.01)。PM2.5濃度100 mg/L處理RTE細(xì)胞不同時(shí)間，可見(jiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3II/LC3I逐漸增大，呈時(shí)間依賴(lài)性，在48h最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

自噬是細(xì)胞受到刺激后吞噬自身的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，最終在溶酶體內(nèi)降解吞噬物，藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，在生物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的功能。但自噬是一把雙刃劍，同時(shí)也參與了病理過(guò)程的發(fā)生，自噬過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，造成機(jī)體損傷。研究表明，自噬在慢性氣道疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，且氧化應(yīng)激可促進(jìn)自噬現(xiàn)象的發(fā)生[6-7]。

氧化和抗氧化的失衡已被證實(shí)為COPD等氣道疾病的重要發(fā)病機(jī)制,氧化應(yīng)激的增強(qiáng)可導(dǎo)致氣道上皮的損傷、氣道炎癥細(xì)胞的聚集及凋亡的增加，從多途徑對(duì)氣道進(jìn)行損害[1]。本實(shí)驗(yàn)使用活性氧試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，可見(jiàn)隨著PM2.5濃度增加，ROS活性上升，并且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。這與龍放等[5]報(bào)道的PM2.5可導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)相符合。

當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生自噬作用或自噬增強(qiáng)時(shí)，LC3I通過(guò)類(lèi)泛素化酶反應(yīng)與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成 LC3II，而隨著 LC3II 含量的增加，自噬小體數(shù)量增加,因此LC3II/LC3I可做為自噬強(qiáng)度的標(biāo)志[8-9]。實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)隨著PM2.5暴露處理的時(shí)間延長(zhǎng)及濃度的增加，細(xì)胞自噬的程度越強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察RTE細(xì)胞的增殖，結(jié)果可見(jiàn)隨著PM2.5濃度的增大及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)變差，增值率降低，損傷嚴(yán)重，在PM2.5200 mg/L 最為明顯。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)龍放[5]的觀點(diǎn)：PM2.5可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)氧自由基等ROS的含量從而達(dá)到對(duì)機(jī)體損害。在低濃度、短時(shí)間PM2.5的作用下ROS活性輕度升高，可刺激細(xì)胞自噬增強(qiáng)，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞存活率無(wú)明顯下降。但隨著PM2.5濃度的升高及時(shí)間的延長(zhǎng)，ROS活性明顯增強(qiáng)，這樣使自噬過(guò)度，會(huì)因過(guò)度“吞噬”胞內(nèi)物質(zhì)而造成細(xì)胞死亡，從而損傷機(jī)體。

總之，自噬和氧化應(yīng)激均參與PM2.5誘導(dǎo)的慢性氣道炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，且兩者關(guān)系密切。自噬在一定程度上可以降低氧化應(yīng)激造成的損傷，但隨著氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，自噬反而會(huì)加重細(xì)胞的損害。

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(收稿：2016-08-10)

The effects of PM2.5 on oxidative stress and autophagy of tracheal epithelial cell

Li Dongfan，Du Xushen,Liu An.

Department of Respiratory Medicine，Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003)

Objective：To study the effects of PM2.5on oxidative stress and autophagy of tracheal epithelial cell. Methods：After RTE cells were treated by different concentrations of PM2.5collected and prepared, cell increment rate was determined by MTT colorimetric method, whether free radical generation of intracellular reactive oxygen species (ROS) was detected with flow cytometry, whether microtubule associated protein light 1 chain 3 I protein 1 (LC31) and LC3II was expressed with Western Blot. Results： After treated by PM2.5100 mg/L and 200 mg/L, Cell survival rate were significantly decreased with concentration and time dependence, PM2.5can also increase the intracellular ROS level and LC3 II protein expression with concentration and time dependence. Conclusion： Airway epithelia cells may be damaged by PM2.5through oxidative stress and autophagy in which course oxidative stress could promote cell excessive autophagy.

Epithelial cells/physiology Oxidative stress Autophagocytosis @PM2.5

*西安市科技攻關(guān)項(xiàng)目[SF-1509(1)]

上皮細(xì)胞/生理學(xué) 氧化性應(yīng)激 自吞噬作用 @PM2.5

R329.28

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.01.001