周凌飛，海 娣，胡夢琪，魏穎穎，李 劼

(湖南省人民醫(yī)院婦科，湖南 長沙 410005)

DC-CTL免疫細胞對卵巢上皮癌細胞的靶向性治療研究

周凌飛，海 娣，胡夢琪，魏穎穎，李 劼

(湖南省人民醫(yī)院婦科，湖南 長沙 410005)

目的 探討經(jīng)樹突狀細胞(DC)誘導(dǎo)的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)免疫細胞靶向性的抑制卵巢上皮癌細胞的機制，為臨床上DC-CTL治療卵巢癌提供理論基礎(chǔ)。方法 無胸腺BALB/C/nu/nu裸小鼠48只，分為4組，每組12只，裸鼠人卵巢癌SKOV3移植瘤模型成功后用未經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞和經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞進行治療，比較各組裸鼠移植瘤體積和重量、抑瘤率、移植瘤miRNAlet-7表達和HMGA2蛋白表達的差異。結(jié)果 DC-CTL組和CTL組裸鼠的移植瘤體積和移植瘤重量低于模型對照組(F值分別為8.175、6.823，均P<0.05)，DC-CTL組裸鼠的移植瘤體積和移植瘤重量低于CTL組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.244，P<0.05)；DC-CTL組裸鼠的抑瘤率(69.57±10.81)%高于CTL組(42.35±8.15)%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.965，P<0.05)；DC-CTL組和CTL組裸鼠的移植瘤miRNAlet-7表達均高于模型對照組(F=7.528，P<0.05)，DC-CTL組裸鼠的移植瘤miRNAlet-7表達(1.69±0.40)高于CTL組(1.17±0.39)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.964，P<0.05)；DC-CTL組和CTL組裸鼠的HMGA2蛋白表達的ISH評分均低于模型對照組(F=6.419，P<0.05)，DC-CTL組裸鼠的HMGA2蛋白表達的ISH評分(15.31±1.72)低于CTL組(17.18±1.86)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.143，P<0.05)。結(jié)論 經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞能夠明顯抑制裸鼠卵巢癌移植瘤的生長，其機制可能為促進let-7表達和抑制HMGA2蛋白表達有關(guān)。

裸鼠卵巢癌移植瘤；樹突狀細胞；胞毒性T淋巴細胞；靶向性研究

卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是一種常見的卵巢惡性腫瘤類型[1]。目前臨床上多采用卵巢癌腫瘤細胞減滅術(shù)以及紫杉醇和鉑類聯(lián)合化療的方式治療卵巢上皮癌，但治療效果并不理想，而對晚期和復(fù)發(fā)的患者效果更差[2]。有研究表明，惡性腫瘤局部樹突狀細胞(dendritic cell，DC)數(shù)量及功能狀態(tài)通常與惡性腫瘤的進展之間存在密切聯(lián)系[3-4]。為了進一步探討經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞靶向性的抑制卵巢上皮癌細胞的機制，本研究制備了卵巢癌凍融抗原負載的樹突狀細胞誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，并建立了卵巢癌SKOV3細胞裸鼠移植瘤動物模型，探討了DC-CTL對卵巢癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用以及對HMGA2蛋白表達的影響，為臨床上提供了理論依據(jù)。

1實驗動物與方法

1.1實驗動物和材料

無胸腺BALB/C/nu/nu裸小鼠48只，購置于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體重16～22g，平均體重(15.11±1.94)g，周齡4～6周，平均周齡(4.54±0.22)周。

1.2細胞株

人卵巢癌細胞株SKOV3購置于ATCC(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物種保藏委員會細胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心)。

1.3卵巢癌凍融抗原的制備

將人卵巢癌SKOV3細胞置于含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并用0.25%胰蛋白酶進行消化并制成細胞懸液，密度大約為1×106個/mL。隨后將血細胞放入液氮中10min，取出后迅速放入100℃水浴中，以此反復(fù)凍融3次；用臺式離心機1 500r/min離心20min，隨后收集上清，再用8 000r/min離心1h，將上清用微孔濾膜進行過濾，濾液于-20℃下保存?zhèn)溆?，即為卵巢癌凍融抗原?/p>

1.4樹突狀細胞誘導(dǎo)細胞毒性T細胞的制備方法

將采集的新鮮臍血加入等體積比例的PBS緩沖液(含0.6%枸櫞酸鈉)進行稀釋；隨后再加入等體積的淋巴細胞分離液以2 000r/min離心30min，收集單個核細胞層并將細胞進行洗滌和計數(shù)。以5倍體積的PBS充分洗滌單個核細胞懸液以獲得足月妊娠健康產(chǎn)婦臍血單個核細胞(cord blood mononuclear cells，CBMC)，再用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將CBMC重懸后于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)2h。向貼壁細胞中加入100ng/mL粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte- macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和50ng/mL白細胞介素-4(interlukin-4，IL-4)進行DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每半日更換培養(yǎng)液并補加細胞因子，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7d。待細胞培養(yǎng)結(jié)束則加入卵巢癌凍融抗原致敏DC(抗原加入量以凍融前卵巢癌細胞的量計)，并于次日用0.25%胰蛋白酶進行消化以制成細胞懸液，用于后續(xù)試驗。

1.5裸鼠卵巢癌移植瘤模型方法和裸鼠分組及治療方法

1.5.1裸鼠卵巢癌移植瘤模型方法

將SKOV3細胞菌株在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基上于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，待細胞長滿瓶底后用0.1%胰蛋白酶消化成單個細胞，并以10%胎牛血清終止消化。將培養(yǎng)液置離心管中以2 000r/min離心5min，棄去上清液后加入PBS吹散混勻并稀釋成2.5×107個/mL的單細胞懸液。按照每只0.2mL的劑量將單細胞懸液接種于裸鼠背側(cè)近后肢處皮下。

1.5.2實驗裸鼠分組

將48只裸鼠隨機分為4組，每組12只：①空白對照組，不做任何處理做空白對照；②模型對照組，裸鼠移植瘤模型成功后注射生理鹽水做模型對照；③CTL組，裸鼠移植瘤模型成功后注射未經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞；④DC-CTL組，裸鼠移植瘤模型成功后注射經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞。

1.5.3治療方法

接種7天后開始治療，CTL組和DC-CTL組分別腹腔注射未經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞和經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞，每次注射10μL，1次/周，連續(xù)4周。模型對照組腹腔注射同體積的生理鹽水，空白對照組不做任何處理。

1.6裸鼠移植瘤miRNAlet-7表達和HMGA2蛋白表達的方法

將裸鼠移植瘤組織用Trizol試劑盒提取RNA后加反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進行反轉(zhuǎn)錄，所得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌水稀釋5～50倍以熒光定量PCR儀進行擴增并檢測，熒光定量PCR儀為美國應(yīng)用生物技術(shù)公司生產(chǎn)，型號為FS-7900。

采用酶標(biāo)免疫法檢測HMGA2蛋白表達，酶標(biāo)儀為德國拜發(fā)公司生產(chǎn)，型號為880；免疫試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.7觀察指標(biāo)及檢測方法

比較各組裸鼠在7d、14d、21d時的體重的差異；21d時處死各組裸鼠，比較各組裸鼠移植瘤體積和移植瘤重量的差異；計算抑瘤率(%)=(1-治療組裸鼠移植瘤重量)/模型組裸鼠移植瘤重量×100%，比較CTL組和DC-CTL組抑瘤率的差異；比較各組裸鼠移植瘤miRNAlet-7表達和HMGA2蛋白表達的差異。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組裸鼠不同時間點平均體重的變化比較

各組裸鼠在實驗過程中一般情況良好，飲食尚可、大便良好，無精神萎靡和活動遲緩等現(xiàn)象，均未出現(xiàn)死亡；在7d時各組裸鼠的體重均無明顯差異(P>0.05)；在14d和21d時，移植瘤模型的裸鼠體重均高于空白對照組(P<0.05)，免疫細胞治療組的裸鼠體重均低于模型對照組(P<0.05)，而DC-CTL免疫細胞治療組的裸鼠體重低于CTL組(P<0.05)，見表1。

Table 1 Comparison of average body weight at different time points among each group ±S)

注：a與空白對照組比較P<0.05，b與模型對照組比較P<0.05，c與CTL組比較P<0.05。

2.2各組裸鼠21天時移植瘤體積和移植瘤重量比較

模型對照組裸鼠在21d時的移植瘤體積(418.26±53.83)mm3和移植瘤重量(1.35±0.34)g，CTL組裸鼠的移植瘤體積(393.17±41.72)mm3和移植瘤重量(0.92±0.27)g，DC-CTL組裸鼠的移植瘤體積(325.65±38.92)mm3和移植瘤重量(0.72±0.25)g，DC-CTL組和CTL組裸鼠的移植瘤體積和移植瘤重量低于模型對照組，DC-CTL組裸鼠的移植瘤體積和移植瘤重量低于CTL組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組裸鼠21d時抑瘤率比較

DC-CTL組裸鼠的抑瘤率(69.57±10.81)%高于CTL組(42.35±8.15)%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

Table 2 Comparison of volume and weight of transplanted tumor at 21st day among each ±S)

注：a與模型對照組比較#P<0.05，b與CTL組比較P<0.05

組別例數(shù)(n)抑瘤率(%)tP模型對照組12-6．956<0．001CTL組1242．35±8．15DC?CTL組1269．57±10．81

2.4各組裸鼠移植瘤miRNAlet-7表達比較

DC-CTL組和CTL組裸鼠的移植瘤miRNAlet-7表達均高于模型對照組，DC-CTL組裸鼠的移植瘤miRNAlet-7表達(1.69±0.40)高于CTL組(1.17±0.39)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

組別例數(shù)(n)miRNAlet?7表達FP模型對照組120．93±0．457．5280．011CTL組121．17±0．39aDC?CTL組121．69±0．40ab

注：a與模型對照組比較P<0.05，b與CTL組比較P<0.05。

2.5各組裸鼠移植瘤HMGA2蛋白表達的ISH評分比較

DC-CTL組和CTL組裸鼠的HMGA2蛋白表達的ISH評分均低于模型對照組，DC-CTL組裸鼠的HMGA2蛋白表達的ISH評分(15.31±1.72)低于CTL組(17.18±1.86)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

Table 5 Comparison of ISH scores of HMGA2 protein expression among each ±S)

注：a與模型對照組比較P<0.05，b與CTL組比較P<0.05。

圖1 21d時裸鼠和移植瘤一般情況圖

Fig.1 General picture of nude mice and transplanted tumor at 21st day

圖2 模型組移植瘤HMGA2蛋白表達免疫組化圖

Fig.2 Immunohistochemistry picture of HMGA2 protein expression of transplanted tumor in model group

圖3 CTL組移植瘤HMGA2蛋白表達免疫組化圖

Fig.3 Immunohistochemistry picture of HMGA2 protein expression of transplanted tumor in CTL group

圖4 DC-CTL組移植瘤HMGA2蛋白表達免疫組化圖

Fig.4 Immunohistochemistry picture of HMGA2 protein expression of transplanted tumor in DC-CTL group

3討論

3.1卵巢上皮癌現(xiàn)狀

卵巢上皮癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,其發(fā)病率和致死率都較高，患者的五年生存率僅為25%～30%，嚴重威脅著廣大女性的生命安全[5-6]。目前對卵巢癌的治療方式也較為單一，大部分患者均通過卵巢癌細胞減滅術(shù)+術(shù)后化療的方法治療，但術(shù)后的復(fù)發(fā)率較高，對晚期或后期的治療效果也較差[7]。因此，探索新的卵巢癌治療藥物并制定個體化治療方案對提高卵巢癌患者的生存率至關(guān)重要。有研究表明，卵巢癌患者的微環(huán)境中大量存在腫瘤細胞釋放的白細胞介素-10(interlukin-10，IL-10)等免疫抑制分子，而這些免疫抑制分子可降低DC表面CD80以及CD86等共刺激分子的表達，從而減少Th1型細胞因子白細胞介素-12(interlukin-12，IL-12)的分泌并阻斷T細胞抗腫瘤活性，導(dǎo)致腫瘤新生血管生成并最終影響卵巢腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8-10]。而腫瘤細胞與樹突狀細胞的融合疫苗可表達惡性腫瘤細胞的所有抗原并產(chǎn)生多克隆的細胞毒性T淋巴細胞，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生腫瘤特異性免疫反應(yīng)。腫瘤疫苗還能通過表達組織相容性抗原II、共刺激因子以及黏附因子等的方式為腫瘤免疫提供第二信號，最終促使細胞產(chǎn)生抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答[11]。國內(nèi)外已有大量動物實驗表明，腫瘤細胞/DC融合疫苗在消退腫瘤方面作用明顯，且對機體無嚴重毒副作用[12]。

3.2DC-CTL對腫瘤的抑制效果

為了進一步探討DC-CTL免疫細胞治療的靶向性研究及其抑制卵巢上皮癌細胞的機制，本研究將裸鼠卵巢癌移植瘤模型成功后分作3組，分別注射生理鹽水、未經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞和經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞進行治療，并比較分析了各組裸鼠移植瘤體積和重量、抑瘤率、移植瘤miRNAlet-7表達和HMGA2蛋白表達的差異，從而為DC-CTL應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療及針對患者制定個體化治療方案提供了理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明，各組裸鼠在實驗過程中一般情況良好，飲食尚可、大便良好，無精神萎靡和活動遲緩等現(xiàn)象，CTL組和DC-CTL免疫細胞治療組的裸鼠體重均低于模型對照組(P<0.05)，且DC-CTL免疫細胞治療組的裸鼠體重更低，說明注射未經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞和經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞均能在一定程度上抑制腫瘤的發(fā)展，但經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞的抑制效果更為明顯。DC-CTL組和CTL組裸鼠的移植瘤體積和移植瘤重量明顯低于模型對照組，而DC-CTL組裸鼠的移植瘤體積和移植瘤重量均低于CTL組，且21d時DC-CTL組裸鼠的抑瘤率明顯高于CTL組，更一步證實了經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞對腫瘤的抑制效果更為明顯。

3.3DC-CTL對mi RNA和HMGA2表達的影響作用

Micro RNA(mi RNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼小分子RNA，主要由22個核苷酸組成，其中l(wèi)et-7家族是目前研究較為廣泛的miRNA之一，其在卵巢組織中常常高度表達[13]。有研究表明，miRNAlet-7可通過抑制原癌基因RAS、HMGA2、c-Myc 等的表達而抑制腫瘤細胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，進而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14]。本研究通過熒光定量PCR法對各組裸鼠移植瘤中miRNAlet-7進行檢測發(fā)現(xiàn)，DC-CTL組和CTL組的miRNAlet-7表達量較高，且DC-CTL組的更高，提示DC-CTL能有效的促進miRNAlet-7的表達，進而抑制腫瘤的發(fā)展。高遷移率蛋白A2(high mobility group A2，HMGA2)是一種重要的染色體蛋白質(zhì)，其在生物體內(nèi)的過度表達與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)，這與本研究的結(jié)果基本一致[15]。本研究通過免疫組織化學(xué)法對各組裸鼠移植瘤中HMGA2蛋白的表達情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，DC-CTL組和CTL組中HMGA2蛋白的表達量明顯低于對照組，且DC-CTL組的更低，說明DC-CTL能有效抑制HMGA2蛋白的表達，進而抑制裸鼠卵巢癌移植瘤的生長。

綜上所述，經(jīng)DC誘導(dǎo)的CTL免疫細胞能夠明顯促進let-7表達并同時抑制HMGA2蛋白表達，進而抑制裸鼠卵巢癌移植瘤的生長。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：韓曉兵]

Targeted therapy of ovarian epithelial cancer by DC-CTL immune cells

ZHOU Ling-fei, HAI Di, HU Meng-qi, WEI Ying-ying,LI Jie

(Department of Gynecology, Hunan People’s Hospital, Hunan Changsha 410005, China)

Objective To investigate the mechanism of targeted inhibiting epithelial ovarian cancer(EOC) by cytotoxic T lymphocyte (CTL) immune cells induced by dendritic cell (DC) so as to provide theoretical basis for clinical treatment of ovarian cancer by DC-CTL. Methods Forty-eight BALB/C/nu/nu nude mice were divided into 4 groups with 12 in each group. After SKOV3 ovarian cancer cells transplanted tumor model was successful, nude mice were treated with CTL immune cells without DC induction and DC induced CTL immune cells. Comparison was made among different groups in volume and weight of transplanted tumor, tumor inhibition rate, miRNAlet-7 expression and HMGA2 protein expression. Results The tumor volume and weight of transplanted tumor in DC-CTL group and CTL group were lower than those in model group (Fvalue was 8.175 and 6.823, respectively, bothP<0.05). Those in DC-CTL group were lower than those in CTL group with statistical differences (t=13.244,P<0.05). The tumor inhibition rate (69.57±10.81%) in DC-CTL group was higher than that in CTL group (42.35±8.15%), and the difference was statistically significant (t=6.965,P<0.05). The expression of miRNAlet-7 in DC-CTL group and CTL group was higher than that in model group (F=7.528,P<0.05), and that in CTL group (1.69±0.40) was significantly higher than that in DC-CTL group (1.17±0.39) with significant difference (t=2.964,P<0.05). The ISH score of HMGA2 protein expression in DC-CTL group and CTL group was lower than that in model group (F=6.419,P<0.05), and that in DC-CTL group (15.31±1.72) was lower than that in CTL group (17.18±1.86) with significant difference (t=3.143,P<0.05). Conclusion CTL immune cells induced by DC can significantly inhibit the growth of ovarian cancer transplanted tumor in nude mice, and the mechanism may be related to the promotion of let-7 expression and inhibition of HMGA2 protein expression.

ovarian cancer transplanted tumor in nude mice; dendritic cell (DC); cytotoxic T lymphocyte (CTL); targeting research

2016-04-12

周凌飛(1990-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

李 劼，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.11.016

R711.7

A

1673-5293(2016)11-1339-04