李金鴿，米 陽，徐葉紅，王艷霞，李蘭蘭

(西北婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)二科，陜西 西安，710061)

mTOR在乳腺癌患者中的表達及意義

李金鴿，米 陽，徐葉紅，王艷霞，李蘭蘭

(西北婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)二科，陜西 西安，710061)

目的 探討mTOR、p-mTOR在乳腺癌中的表達及臨床意義，為乳腺癌的臨床治療提供理論依據(jù)。方法 應(yīng)用免疫組織化學SP方法及Western 印跡方法研究90例乳腺組織中mTOR、p-mTOR的表達，其中乳腺癌組織50例(乳腺導管原位癌5例、浸潤性特殊乳腺癌10例，浸潤性小葉癌14例，浸潤性導管癌21例)；乳腺良性病變40例。結(jié)果 mTOR在乳腺癌的陽性表達率為64.00%(32/50), 與乳腺良性病變組織相比無統(tǒng)計學差異(χ2=0.128，P>0.05)，但與乳腺癌旁組織比較差異顯著(χ2=7.758，P<0.05)；p-mTOR在乳腺癌的陽性表達率為72.00%(36/50)，與癌旁組織和乳腺良性病變相比均有顯著性差異(χ2值分別為11.055、3.927，均P<0.05)。此外，mTOR、p-mTOR的表達與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2值分別為4.271、6.913，P<0.05)，與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期、組織學類型無關(guān)(χ2值分別為0.298、0.613、0.539、0.094，0.010、0.105、2.797、0.206，均P>0.05)。結(jié)論 mTOR、p-mTOR在乳腺癌中表達增加可能與乳腺癌發(fā)生及乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示其可能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起促進作用。

mTOR；p-mTOR；乳腺腫瘤；表達

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，近年研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號傳導通路在細胞生存、生長，與增殖中起中心調(diào)控作用，在許多人類腫瘤均呈高表達。多種惡性腫瘤的發(fā)生與它所介導的信號傳導通路的異常有關(guān)，已成為腫瘤治療的新靶點[1]。但有關(guān)mTOR、p-mTOR在乳腺組織中的表達情況的研究較少。本實驗擬對50例乳腺癌病人石蠟包埋切片中mTOR和 p-mTOR的表達進行聯(lián)合檢測，探討mTOR和p-mTOR在乳腺癌中的表達及臨床意義，并成為乳腺癌治療的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

乳腺組織來自西北婦女兒童醫(yī)院乳腺科手術(shù)切除標本共90例。所有標本均行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)及免疫組化檢測?；颊呔鶠榕?，年齡為16～78歲，中位年齡47歲，要求術(shù)前未行放療、化療及免疫治療，依據(jù)最新世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization，WHO)乳腺癌分類標準進行組織學分類：5例乳腺導管原位癌，10例浸潤性特殊乳腺癌(髓樣癌)，14例浸潤性小葉癌，21例浸潤性導管癌，50例乳腺癌中有淋巴轉(zhuǎn)移的29例。依據(jù)國際抗癌協(xié)會腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor node metastasis，TNM)分期方案將乳腺癌分為：14例Ⅲ期，19例Ⅱ期，17例0期Ⅰ期，再取30例乳腺良性病變，10例癌旁乳腺組織。另取手術(shù)切除乳腺癌旁組織、 乳腺良性病變和乳腺癌組織標本30例，以備蛋白質(zhì)印跡法(western blot，WB)分析。

1.2主要試劑與方法

兔抗人mTOR單克隆抗體 兔抗人磷酸化mTOR單克隆抗體(Cell Signaling 公司)免疫組化染色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司) 生物素化二抗、DAB濃縮顯色液、DAB稀釋液 (武漢博士德生物試劑公司)采用免疫組化SP法。對照設(shè)置以同等稀釋度的正常家兔血清及PBS代替一抗作陰性及空白對照，陽性對照采用試劑盒自帶陽性切片免疫組化染色結(jié)果。Western Blot分別取手術(shù)切除乳腺良性病變和乳腺癌組織標本30例放入液氮中凍存再放入負80度冰箱。嚴格按照Western Blot試驗步驟。

1.3結(jié)果判斷標準

免疫組化結(jié)果判定：mTOR定位于細胞漿，p-mTOR定位于細胞漿和細胞核，棕黃色顆粒出現(xiàn)在細胞漿和細胞核為陽性細胞。連續(xù)觀察10個高倍視野(×400)后，選用半定量計分法判定結(jié)果，以染色百分比計分×染色強度計分，4分以上定為陽性，將0～4分定為陰性。 Western Blot結(jié)果判定：由灰度值測定來分析各組蛋白的相對含量。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行所有統(tǒng)計分析。臨床病理參數(shù)間的關(guān)系與mTOR和p-mTOR表達采用χ2檢驗；Western Blot結(jié)果采用方差分析。P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 mTOR、p-mTOR在乳腺癌、乳腺良性病變及乳腺癌旁組織中的組織表達及定位

mTOR主要定位于細胞漿，呈棕黃色顆粒，p-mTOR定位于細胞漿和細胞核，呈棕黃色顆粒(見圖1)。50例乳腺癌組織中有32例mTOR呈陽性表達，其陽性率高達64.00%，乳腺良性病變的陽性率為60.00%，而對照的10例癌旁組織僅1例(10.00%)呈陽性表達。乳腺癌中mTOR的陽性表達率高于乳腺良性病變組織，但統(tǒng)計學處理無顯著性差異(P>0.05)。乳腺癌與乳腺癌旁組織比較有顯著性差異(P<0.05)。p-mTOR在乳腺癌、乳腺良性病變組織、乳腺癌旁組織、中的陽性表達率分別為72.00%、50.00%、10.00%，乳腺癌分別與乳腺癌旁組織、乳腺良性病變組織比較均有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

圖1 mTOR、p- mTOR在乳腺癌不同組織學類型中的陽性表達[A、E乳腺良性病變(SP,×200); B、F 乳腺導管癌(SP,×200); C、G乳腺小葉癌(SP,×200) ;D、H乳腺髓樣癌(SP,×200)]

Fig .1 Positive expressions of mTOR and p-mTOR in different histological types of breast cancer [A、E benign breast lesions (SP,×200); B、F ductal breast cancer (SP,×200); C、G breast lobular cancer (SP,×200); D、H medullary breast cancer (SP,×200) ]

表1 mTOR、p-mTOR在乳腺癌、乳腺良性病變及乳腺癌旁組織中的表達(n)

注：進行組間比較用χ2分割法?！锶橄倭夹圆∽兣c癌旁組織組間比較；■乳腺癌與乳腺良性病變組間比較；▲乳腺癌與乳腺癌旁組織組間比較。

表2 mTOR 、p-mTOR在乳腺不同組織學類型中Western blot灰度值分析

注：mTOR：癌旁組織分別與乳腺良性病變、乳腺癌比較，P<0.05；乳腺良性病變與乳腺癌比較，P>0.05。p-mTOR：癌旁組織分別與 乳腺良性病變、乳腺癌比較，P<0.05；乳腺良性病變與乳腺癌比較，P<0.05。

2.2 mTOR和p-mTOR在乳腺癌、乳腺良性病變及乳腺癌旁組織中的蛋白表達檢測

在乳腺癌旁組織、乳腺良性病變組織、乳腺癌中均有mTOR 和p-mTOR的蛋白條帶(289KD)出現(xiàn)(見圖2)；經(jīng)吸光度測定灰度值(見表2)，從乳腺癌旁組織、乳腺良性病變組織、乳腺癌呈逐漸升高趨勢與免疫組化結(jié)果比較總體趨勢一致。

2.3mTOR和p-mTOR在乳腺癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的mTOR、p-mTOR的陽性表達率分別為22例(75.86%)、25例(86.21%)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的mTOR、p-mTOR的陽性表達率分別為10例(47.61%)、11例(52.38%)，兩組間相比具有顯著性差異(P<0.05)，但mTOR、p-mTOR的表達與乳腺癌病人的臨床分期、組織學類型、年齡及腫瘤大小無關(guān)(均P>0.05)，見表3。

注：A為乳腺癌旁組織，B為乳腺良性病變組織，C為乳腺癌組織，β-actin為內(nèi)參

圖2 mTOR、p-mTOR在乳腺癌不同組織學類型中的蛋白表達

Fig. 2 Protein expressions of mTOR and p-mTOR in different histological types of breast cancer (A: adjacent tissue of breast cancer，B: benign breast lesions，C: breast cancer tissue，β-actin for reference)

表3 mTOR、p- mTOR在乳腺癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

3討論

3.1 mTOR在乳腺癌中的表達

乳腺癌是一種嚴重威脅人類生命安全的腫瘤，是婦女最常見的惡性腫瘤之一。自主的和不受控制的生長是惡性腫瘤的特征之一，人類大部分惡性腫瘤存在增值信號傳導途徑的過度表達。有研究發(fā)現(xiàn)mTOR所介導的信號傳導通路與細胞增殖和細胞凋亡有密切關(guān)系，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種常見腫瘤(乳腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等)的發(fā)生與該通道密切相關(guān)[2-3]。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，mTOR的磷酸化水平從正常乳腺上皮組織、不典型增生到惡性轉(zhuǎn)化再到腫瘤浸潤漸次增加。我們采用免疫組化SP法研究mTOR、p-mTOR在乳腺癌中的表達,結(jié)果顯示；乳腺癌旁組織、乳腺良性病變、乳腺癌中mTOR、p-mTOR的陽性率分別為10.00%、60.00%、64.00%和10.00%、50.00%、72.00%,呈逐漸升高趨勢，Western blot檢測結(jié)果與免疫組化結(jié)果比較總體趨勢一致，提示mTOR、p-mTOR的高表達在乳腺正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化和癌細胞增值中起重要調(diào)控作用。同時我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌中mTOR的陽性表達率雖然高于乳腺良性病變組織，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而p-mTOR的表達在乳腺良性病變組織與乳腺癌兩組間比較有顯著性差異(P<0.05)。p-mTOR作為mTOR的活性形式在乳腺癌中陽性表達率明顯高于mTOR的陽性表達率，這一結(jié)提示在促進乳腺細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化中mTOR磷酸化激活起著重要作用，可能為乳腺癌治療提供新靶點。有文獻報道，激活后的mTOR進一步磷酸化它的下游分子，核糖體蛋p70S6k和翻譯抑制分子eIF24E結(jié)合蛋白1，從而啟動蛋白質(zhì)的翻譯[4]。是蛋白質(zhì)合成的正調(diào)控信號,隨著腫瘤惡性度提高，mTOR和p-mTOR的表達量提高。本實驗的結(jié)果也證明了這一點。免疫組化結(jié)果表明，mTOR主要表達在腫瘤細胞胞漿，p-mTOR主要表達在細胞漿及細胞核。推測mTOR被上游信號因子激活發(fā)生磷酸化后生成p-mTOR，p-mTOR進入細胞核后在調(diào)節(jié)下游在翻譯過程中起重要作用，從而在翻譯水平上而促進乳腺細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，與文獻報道一致。有研究證實，mTOR在轉(zhuǎn)錄水平也有一定的影響，磷酸化mTOR可激活信號轉(zhuǎn)導與激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等轉(zhuǎn)錄激活因子。mTOR信號傳導通路激活后可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，促使細胞周期進展，進而促進細胞的生存和增殖，同時在腫瘤的形成中扮演重要角色，參與血管形成，也參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。已證實乳腺癌中存在PI3K/Akt/mTOR途徑異常，Akt磷酸化mTOR的Ser2448位點，從而激活mTOR和它的下游途徑，控制細胞增殖與轉(zhuǎn)化所需特殊蛋白質(zhì)的翻譯[5-6]。Laughner等在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號能調(diào)控低氧誘導因子的表達，促使其下游血管內(nèi)皮生長因子的轉(zhuǎn)錄，從而使內(nèi)皮細胞遷移形成新生血管,提供腫瘤細胞血供。本實驗結(jié)果表明，mTOR、p-mTOR的表達與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示mTOR信號傳導途徑激活可能進一步參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。Tuck等在乳腺癌及肝癌細胞中的研究均發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(osteopontin，OPN)為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，它的異常表達依賴mTOR的調(diào)控。另外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)mTOR、p-mTOR的陽性表達率隨著乳腺癌的臨床分期呈上升趨勢,但無統(tǒng)計學意義，這一結(jié)果尚需擴大樣本量進一步研究。

3.2 mTOR與腫瘤的關(guān)系

目前mTOR與腫瘤關(guān)系的直接模式尚未確立，研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號傳導通路的異常與細胞的惡性轉(zhuǎn)化、多種腫瘤的形成有關(guān)。mTOR信號傳導上游的蛋白如PI3K、Akt等都具有細胞轉(zhuǎn)化、促進腫瘤形成的潛能蛋白。參與多種腫瘤的形成并起重要作用。生長因子可通過跨膜信號轉(zhuǎn)導激活PI3K，生成Ptdln(3，4)P2、Ptdln(3，4，5)P3，正常情況下上述兩種產(chǎn)物受人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)的負性調(diào)控。PTFN是3-磷酯酞肌醇磷酸酶，是腫瘤抑制基因Pten的產(chǎn)物?？墒筆tdln (3，4)P2、Ptdln(3，4，5)P3去磷酸化后失活。當PTEN的發(fā)生突變可使PI3K及產(chǎn)物增加、Akt活性增強，促使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。PTFN也是mTOR的負性調(diào)節(jié)因子，他發(fā)生功能缺失性突變出現(xiàn)在多種惡性腫瘤中，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等腫瘤中[7]。在這些腫瘤的PI3K及產(chǎn)物濃度、Akt活性明顯升高。利用mTOR的選擇性抑制劑rapamycin可以逆轉(zhuǎn)Akt轉(zhuǎn)化的細胞表型。因此，mTOR信號通路的與惡性腫瘤關(guān)系的進一步研究為惡性腫瘤的治療提供了新的思路。特別是mTOR抑制劑雷帕霉素及其衍生物加來曲唑(temsirolimus，CCI-779)、依維莫司(everolimus，RAD001)已用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的II期臨床實驗。

綜上所述，mTOR p-mTOR在乳腺癌中表達增加可能是介導乳腺癌發(fā)生的主要機制之一；mTOR p-mTOR的表達與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示其可能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要促進作用，mTOR、p-mTOR的陽性表達率隨著乳腺癌的臨床分期呈上升趨勢,但無統(tǒng)計學意義，這一結(jié)果尚需擴大樣本量進一步研究，mTOR、p-mTOR在浸潤性小葉癌和浸潤性導管癌中的表達差異無顯著性。

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[專業(yè)責任編輯：任 予]

Expression and clinical significance of mTOR in breast cancer

LI Jin-ge, MI Yang, XU Ye-hong, WANG Yan-xia, LI Lan-lan

(Second Department of Obstetrics, Northwest Women and Children’s Hospital, Shaanxi Xi’an 710061, China)

Objective To study the expression and significance of mTOR and p-mTOR in primary breast carcer so as to provide theoretical basis for clinical treatment of breast cancer. Methods The expressions of mTOR and p-mTOR were studied in breast carcer samples by immunohistochemical (IHC) analysis and Western blot. Results The positive expression rate of mTOR was 64.00% (32/50) in breast cancer tissues, which was not different from that in breast benign lesions (χ2=0.128,P>0.05) but significantly different from that in breast cancer adjacent tissues (χ2=7.758,P<0.05). The positive expression rate of p-mTOR was 72.00% (36/50) in breast cancer tissues, and there was significant difference from that in breast benign lesions and adjacent cancer tissues (χ2value was 11.055 and 3.927, respectively, bothP<0.05). The expressions of mTOR and p-mTOR were correlated with the metastasis of lymph node (χ2value was 4.271 and 6.913, respectively, bothP<0.05) but not correlated with patients' age, tumor size, different clinical type and histological type (χ2value was 0.298, 0.613, 0.539, 0.094, 0.010, 0.105, 2.797 and 0.206，respectively, allP>0.05).Conclusion Higher expressions of mTOR and p-mTOR may be correlated with breast cancer and metastasis of lymph node, indicating their role in pathogenesis and development of breast cancer.

mTOR; p-mTOR; breast tumor; expression

2016-06-06

李金鴿(1980-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事產(chǎn)科臨床工作。

米 陽，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.11.015

R655.8

A

1673-5293(2016)11-1335-04