張小龍

左西孟旦對(duì)心力衰竭大鼠離體心臟的保護(hù)作用及機(jī)制研究

張小龍

目的 觀察左西孟旦對(duì)心力衰竭大鼠離體心臟功能的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作大鼠心衰模型，使用Langendorff離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)方法，觀察左西孟旦對(duì)心力衰竭大鼠離體心臟功能的影響，運(yùn)用不同阻斷劑干預(yù)后，觀察左西孟旦作用的變化。結(jié)果 左西孟旦可增強(qiáng)心力衰竭大鼠離體心臟功能，其心率減慢，LVSP-LVDP升高，+dP/Dtmax升高，-dP/Dtmax降低，L-NAME、Gli預(yù)處理后，左西孟旦對(duì)心力衰竭心臟功能的作用減弱。結(jié)論 左西孟旦可以明顯改善心力衰竭大鼠離體心臟功能，其作用可能與NO的合成、KATP通道開(kāi)放有關(guān)。

左西孟旦；心力衰竭；離體心臟；心功能

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)嚴(yán)重威脅著人類的健康，它的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，在中國(guó)，成年人心衰的患病率約為0.9%，隨著老齡化社會(huì)的發(fā)展，人群中心衰患者人數(shù)不斷增加。它是缺血性心臟病、高血壓病、心肌病、瓣膜性心臟病等各種病因所致心血管疾病發(fā)展的最終結(jié)局。目前雖然在臨床和基礎(chǔ)研究方面對(duì)CHF的防治取得了一系列重大進(jìn)展，但是CHF的患病率與死亡率不降反升，5年生存率仍然低于50%。因此基于CHF的研究，特別是臨床藥物的研究仍然有重要的意義。左西孟旦(levosimendan，Levo)是一種新型強(qiáng)心藥物，它通過(guò)增加心肌肌鈣蛋白對(duì)Ca2+的敏感性發(fā)揮增強(qiáng)心功能作用，臨床中主要用于心臟功能衰竭的治療和有高手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)或左心室功能損傷病人的支持性治療或心外科手術(shù)選擇性治療[1- 2]，但是無(wú)論基礎(chǔ)還是臨床研究，其對(duì)心臟作用靶點(diǎn)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作大鼠心衰模型，使用Langendorff離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)方法，觀察Levo對(duì)心力衰竭大鼠離體心臟功能的影響，并探討其可能的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 左西孟旦注射液(Levosimendan，Levo，規(guī)格為5 ml：12.5mg)，齊魯制藥有限公司，批號(hào)512007F3，左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(Indo)、四乙胺(Tetraethtylamine，TEA)、格列苯脲(Glibenclamide，Gli)、氯化鋇(BaCl2)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)均購(gòu)自Sigma公司。其余均為化學(xué)試劑國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 Langendorff心臟灌流裝置，Powerlab生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)購(gòu)自澳大利亞ADInstruments公司，恒流泵購(gòu)自蘭格恒流泵有限公司，超級(jí)恒溫器購(gòu)自上海儀典儀表電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重為180 g～220 g。飼料由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，每籠飼養(yǎng)大鼠5只，室溫保持在20 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度50%左右，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將大鼠分為對(duì)照組6只、假手術(shù)組6只、心衰組50只。

1.3 制備心力衰竭大鼠動(dòng)物模型

1.3.1 模型制備 心力衰竭模型制備采用腹主動(dòng)脈縮窄法[3]：健康雄性 Wistar 大鼠，體重180 g～220 g，用40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，四肢及頭部固定于手術(shù)臺(tái)上，開(kāi)腹，止血鉗鈍性分離腹壁肌層，分離腎動(dòng)脈分支稍上處的腹主動(dòng)脈，7號(hào)針頭平行腹主動(dòng)脈，用線結(jié)扎此動(dòng)脈及針頭后，拔出針頭，使腹主動(dòng)脈面積為原面積的40%，假手術(shù)組分離動(dòng)脈后只穿線，不接扎，逐層關(guān)閉腹腔，術(shù)后肌注3 d青霉素以防感染，每天200 U。

1.3.2 模型評(píng)價(jià) 每天早、 中、 晚觀察大鼠精神狀態(tài)、 活動(dòng)情況、 皮毛變化、 飲食情況及呼吸頻率。12周后表現(xiàn)出明顯的CHF體征：表現(xiàn)精神狀態(tài)差，眼瞼分泌物增多，活動(dòng)能力下降，活動(dòng)逐漸減少，進(jìn)食減少，被毛松軟，脫毛，呼吸加快，喜歡聚團(tuán)等。對(duì)大鼠進(jìn)行心功能測(cè)定：隨機(jī)取大鼠，稱重記錄體重(BW)g后麻醉動(dòng)物，麻醉動(dòng)物后分離右頸總動(dòng)脈切開(kāi)后插入直徑 1 mm且有1%肝素的心導(dǎo)管，接BL-420S生物機(jī)能分析系統(tǒng)，緩慢推進(jìn)同時(shí)觀測(cè)動(dòng)脈壓，描記記錄血壓曲線。再繼續(xù)插入，使其通過(guò)主動(dòng)脈瓣進(jìn)入左心室，描記記錄左心室內(nèi)壓(LVP)、心臟舒張期左室內(nèi)壓變化最大速率(±dp/dtmax)等。比較對(duì)照組、假手術(shù)組和心衰組心功能變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將心臟置于預(yù)先備好的4℃的臺(tái)氏液中。從臺(tái)氏液中取出心臟，用雙層濾紙吸干水分，用電子天平準(zhǔn)確稱量全心濕重(HW)g；去除心房及瓣膜組織用電子天平稱心室濕重(VW)g。最后所稱得的結(jié)果計(jì)算出心臟重量指數(shù)(HW/BW)mg/g和心室重量指數(shù)(VW/BW)mg/g。比較對(duì)照組、假手術(shù)組和心衰組的HW/BW和VW/BW。

1.4 離體心臟的制備 大鼠頸總動(dòng)脈插管，心功能測(cè)定結(jié)束后，開(kāi)胸解剖取出心臟，置入4℃臺(tái)氏液中，去除其余組織后置于Landendorff灌流裝置上，用充以95%氧氣和5%二氧化碳的臺(tái)氏液灌流(臺(tái)氏液成分：NaCl 140mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，Glu 10 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，HEPES 5.0 mmol/L)，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.36。起搏電極位于右室，刺激強(qiáng)度設(shè)定為二倍閾強(qiáng)度，刺激頻率為每分鐘200次。將一直徑約4 mm、充有一定臺(tái)式液的乳膠水囊經(jīng)由左心房插入至左心室內(nèi)，水囊導(dǎo)管的一端與壓力換能器連接，將灌流速度調(diào)整為10 mL/min，對(duì)室內(nèi)壓進(jìn)行測(cè)定。擬測(cè)定指標(biāo)為：心率(HR)，左室收縮壓(LVSP)，左室舒張壓(LVDP)，左室壓最大上升速率(+dP/Dtmax)，左室壓最大下降速率(-dP/Dtmax)，主動(dòng)脈收縮壓(LVSP-LVDP)。以主動(dòng)脈收縮壓≥8 kPa；為灌流成功標(biāo)志，穩(wěn)定60 min，待所觀察各心功能指標(biāo)維持穩(wěn)定后，開(kāi)始干預(yù)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 Levo對(duì)心力衰竭離體心臟的作用 抽取心力衰竭大鼠10只，隨機(jī)分為空白組和Levo組各5只?？瞻捉M持續(xù)灌流臺(tái)式液至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，Levo組往灌流液中加入Levo，使灌流液中Levo的終濃度為0.3 μmol/L。觀察兩組大鼠離體心臟的HR、LVSP、LVDP、+dP/Dtmax、-dP/Dtmax等心臟功能指標(biāo)的變化情況。

1.5.2 不同阻斷藥對(duì)Levo作用的影響 將35只心肌肥厚大鼠隨機(jī)分為7組，每組5只，Levo組和Levo+阻斷藥組(n=5)，6種阻斷藥分別為NO合酶(eNOS)抑制劑L-NAME(1×10-4mol/L)、環(huán)氧合酶(COX)抑制劑Indo(1×10-5mol/L)、KV通道阻斷劑4-AP(1×10-3mol/L)、KATP通道阻斷劑Gli(1×10-5mol/L)、KCa通道阻斷劑TEA(1×10-2mol/L)、KiR通道阻斷劑BaCl2(1×10-3mol/L)。待離體心臟灌流穩(wěn)定后，Levo組加入Levo終濃度為0.3 μmol/L的臺(tái)式液，阻斷藥組則加入阻斷劑孵浴10 min后，再加入Levo終濃度為0.3 μmol/L的臺(tái)式液，觀察Levo對(duì)心力衰竭離體心臟的作用。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心力衰竭模型制備鑒定 12周末，心衰組動(dòng)物死亡5只，假手術(shù)組死亡1只。大鼠心功能測(cè)定結(jié)果及心臟、心室重量指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示(見(jiàn)表1、表2)，大鼠心衰模型成功制備。

表1 各組大鼠心功能結(jié)果比較(±s)

表2 各組大鼠HW/BW和VW/BW結(jié)果比較(±s)

2.2 Levo對(duì)心衰大鼠離體心臟功能的影響 與空白相比，Levo可增強(qiáng)衰大鼠離體心臟心功能。心率減慢(P<0.01)，LVSP-LVDP升高P<0.05)，+dP/Dtmax(P<0.01)升高，-dP/Dtmax降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表3。

表3 空白組、Levo組心衰大鼠離體心臟心功能指標(biāo)比較(±s)

2.3 不同阻斷藥對(duì)Levo改善心功能作用的影響 L-NAME及Gli孵浴后，Levo對(duì)離體心臟功能增強(qiáng)作用減弱，與Levo組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；其余阻斷藥孵浴后，Levo對(duì)離體心臟功能影響與Levo組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表4。

表4 Levo組與阻斷藥組心力衰竭大鼠離體心功能指標(biāo)比較(±s)

3 討 論

腹主動(dòng)脈縮窄法所致大鼠心衰模型是慢性心力衰竭研究中常用的動(dòng)物模型，其發(fā)病機(jī)制明確，程度基本相同，與臨床心衰病人的病理變化過(guò)程類似。腹主動(dòng)脈縮窄可以使左心室流出道受阻，后負(fù)荷加重而致心力衰竭。本實(shí)驗(yàn)制作腹主動(dòng)脈縮窄法所致的大鼠心衰模型，12周后，大鼠心力衰竭模型成功建立，各心功能指標(biāo)明顯降低。

Langendorff離體心臟灌流模型是研究心血管疾病的成熟裝置。離體實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于它排除了神經(jīng)、內(nèi)分泌、體液因素以及心臟前、后負(fù)荷對(duì)心功能的影響，可以直觀觀察藥物對(duì)心功能的影響。本研究的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)HR、LVSP、LVDP、±dP/Dtmax是離體心臟灌流中反映心臟收縮與舒張功能的重要指標(biāo)，HR是反映心臟收縮舒張功能最簡(jiǎn)單直觀的指標(biāo)，心率減慢，心輸出量減少可使血壓降低，心率減慢，從而使冠脈灌流時(shí)間增多，最終使心肌得到更多的血液供應(yīng)，對(duì)心臟起保護(hù)作用。LVSP和+dP/Dtmax主要反映心臟的收縮功能，LVDP和-DP/Dtmax主要反映心臟的舒張功能[4]。Levo作為新一代Ⅱ型Ca2+增敏劑，不同的濃度下具有Ca2+增敏、抑制磷酸二酯酶、抗炎抗氧化等作用[5- 6]。本研究結(jié)果表明，和空白組相比，Levo可以使心力衰竭大鼠心率減慢，-DP/Dtmax降低，LVSP-LVDP、+dP/Dtmax則升高，上述心功能指標(biāo)表明，Levo可顯著增強(qiáng)心力衰竭大鼠離體心臟的心功能。

心臟代謝產(chǎn)生的物質(zhì)以及心臟細(xì)胞的蛋白、通道可以通過(guò)調(diào)節(jié)心臟收縮和舒張來(lái)影響心功能。例如一氧化氮(NO)、前列環(huán)素(PGI2)、K+通道等。NO可通過(guò)NO-sGC-cGMP 途徑，使sGC激活促使cGMP 生成，后者則進(jìn)一步作用于cGMP依賴性蛋白激酶使Ca2+內(nèi)流減少，增加Ca2+-ATP酶對(duì)Ca2+的攝取，或直接使收縮蛋白去磷酸化而影響心功能。PGI2是由COX催化花生四烯酸產(chǎn)生的，可舒張冠脈改善心功能。K+通道在調(diào)節(jié)心臟收縮與舒張中具有重要作用，激活心臟的 K+通道，舒張冠狀動(dòng)脈，可以明顯改善心功能[7]。運(yùn)用L-NAME、Gli預(yù)孵心衰心臟后，和單純灌流Levo離體心臟相比，心率加快，LVSP-LVDP降低，+dP/Dtmax降低，-dP/Dtmax升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，NO與KATP通道可能參與了Levo改善心臟收縮舒張功能。

Levo的基礎(chǔ)和臨床研究雖然有了很大的進(jìn)展，但是其詳細(xì)作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚不明確。本研究運(yùn)用離體心衰模型的方法闡明了Levo可以明顯改善心力衰竭大鼠離體心臟功能，其作用可能與NO的合成、KATP通道開(kāi)放有關(guān)。

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(本文編輯王雅潔)

山西省心血管病醫(yī)院(太原 030024)，E-mail：19941680961@qq.com

引用信息：張小龍.左西孟旦對(duì)心力衰竭大鼠離體心臟的保護(hù)作用及機(jī)制研究 [J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(24)：2896-2899.

R541.4 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.014

1672-1349(2016)24-2896-04

2016-09-09)