趙宇航，李鳳明，張 弢，侯曉敏，楊洪兵，董春海

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

煙草乙烯反應(yīng)突變體的抗冷性及機(jī)理分析

趙宇航，李鳳明，張 弢，侯曉敏，楊洪兵，董春海

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

為了深入研究乙烯在植物抵抗逆境脅迫中的作用，以煙草為模式植物，利用幼苗對外源乙烯的“三重反應(yīng)”，篩選得到了40多個乙烯不敏感突變體，其中多數(shù)突變體具有較強(qiáng)的抗冷性；從中選取4個突變體株系，對它們耐受低溫脅迫的生理基礎(chǔ)和作用機(jī)理進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，低溫(0 ℃)脅迫下，煙草乙烯不敏感突變體的電解質(zhì)滲透率顯著低于野生型，而抗氧化酶活性(POD、SOD)以及過氧化氫酶(CAT)活性都高于野生型，說明突變體具有抵抗低溫脅迫的優(yōu)勢生理基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低溫(0 ℃)脅迫下，煙草突變體中冷誘導(dǎo)基因NtCBFs和NtCOR47呈現(xiàn)高水平表達(dá)，乙烯信號傳導(dǎo)途徑中下游基因ERFs的表達(dá)也發(fā)生顯著變化。這些研究為煙草乙烯不敏感突變體株系具有較強(qiáng)的抗冷性提供了直接的分子證據(jù)。

煙草；低溫脅迫；乙烯；抗冷性；突變體

植物與其他多細(xì)胞復(fù)雜生物體的顯著區(qū)別在于植物營固著生活，因而在植物的生活周期中被迫接受各種各樣的不利環(huán)境，如土壤鹽害、干旱、低溫、病原物侵襲、機(jī)械損傷等。逆境脅迫中，低溫是影響植物自然分布的主要限制因子，不僅限制作物的種植范圍，而且還會造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降，幾乎每年都會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。研究表明，植物響應(yīng)低溫脅迫中的基因表達(dá)及分子調(diào)控在植物耐受低溫脅迫中起關(guān)鍵作用[1-3]，但如何利用生物技術(shù)提高植物的抗冷、抗凍性，人們所知甚少。

煙草喜溫暖而濕潤的氣候，屬溫度敏感型植物，對低溫甚為敏感。我國煙區(qū)分布廣泛，各地溫度條件差異很大，比如早春低溫危害是我國南方煙區(qū)普遍存在的問題。在北方煙區(qū)，由于缺乏必要的灌溉條件，每年總有一些煙區(qū)因土壤干旱而影響煙株生長從而造成煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)降低。煙草作為一種模式作物，其生長發(fā)育及基因育種方面的相關(guān)研究也日益受到人們的關(guān)注。前期工作中，筆者利用煙草乙烯不敏感突變體研究其耐旱性及其作用機(jī)制[4]，但煙草突變體的抗冷性及其分子機(jī)制尚未報(bào)道。

乙烯是氣體植物激素，不僅參與植物的生長發(fā)育、果實(shí)成熟、器官衰老等生物過程，乙烯也在植物應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5]。乙烯在植物應(yīng)答逆境脅迫刺激時(shí)可以快速靈敏地形成應(yīng)激反應(yīng)，乙烯敏感性的改變往往影響植物的抗逆性，例如，改變轉(zhuǎn)基因煙草的乙烯信號調(diào)控因子影響植株的耐鹽性[6]；擬南芥的乙烯突變體(etr1-1、ein4-1、ein3-1)對低溫有一定的抗性[7]；在煙草或番茄中過表達(dá)乙烯信號傳導(dǎo)途徑下游的ERFs基因可提高轉(zhuǎn)基因植物對鹽、干旱及低溫脅迫的耐受性[8-13]。本課題組利用煙草幼苗對乙烯特有的“三重反應(yīng)”，利用甲基磺酸乙酯(EMS)化學(xué)誘變獲得的突變體群體中篩選乙烯不敏感突變體。其中，大部分煙草乙烯不敏感突變體對低溫、干旱等逆境脅迫表現(xiàn)出明顯的抗性[4，14]。本研究旨在對煙草乙烯不敏感突變體的抗冷性進(jìn)行深入分析，了解它們耐受低溫脅迫的生理機(jī)制以及應(yīng)答的分子基礎(chǔ)等。這些分析不僅對研究植物的乙烯反應(yīng)與抗逆性之間的關(guān)聯(lián)具有理論指導(dǎo)意義，所獲得的突變體株系在生產(chǎn)中亦具有直接的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草種子由中國農(nóng)科院煙草研究所提供，包括野生型中煙100和經(jīng)過EMS誘變的中煙100的二代突變體種子 (突變體編號為該項(xiàng)課題使用的統(tǒng)一號碼)。

煙草種子使用1%的NaClO溶液(V/V)消毒50～60 min，無菌吐溫水振蕩1 min后再清洗6次，晾干后點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上。4 ℃放置3 d后，置于光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗，25 ℃)；無光照培養(yǎng)即在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)為黑暗培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草乙烯不敏感突變體篩選 將EMS誘變的煙草突變體二代種子進(jìn)行表面消毒，然后將消毒后的種子單粒點(diǎn)播于附加100 μmol/L ACC(Sigma Aldrich)的MS培養(yǎng)基上。4 ℃黑暗條件下放置3 d后，轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 h，然后用錫箔紙包起來于培養(yǎng)室25 ℃ 暗培養(yǎng) 6～7 d后取出，選取下胚軸長且沒有明顯頂鉤的株系轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)。待幼苗生長茁壯后，移栽于營養(yǎng)土中。

1.2.2 煙草乙烯不敏感突變體的抗冷性篩選及分析 煙草乙烯不敏感突變體的抗冷性篩選：將篩選得到的煙草乙烯不敏感突變體種子點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上，4 ℃ 低溫處理3 d后進(jìn)行光照培養(yǎng)12 h，然后置于4 ℃ 低溫環(huán)境下無光照培養(yǎng)60 d。取出后，根據(jù)突變體與野生型幼苗的下胚軸伸長與主根生長的差異，篩選出抗冷性突變體株系。

煙草乙烯不敏感突變體的抗冷性分析：煙草突變體種子點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上，4 ℃ 低溫處理3 d后光照培養(yǎng)12 h，分別置于8，15，25 ℃ 3個溫度條件下培養(yǎng)，每個溫度條件下均設(shè)置光照培養(yǎng)與無光照培養(yǎng)2個處理。每個處理各選取合適培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察、對比突變體與野生型幼苗的下胚軸伸長與主根生長的差異，以此初步分析突變體株系的抗冷性。

1.2.3 抗冷性相關(guān)生理指標(biāo)測定 細(xì)胞膜透性檢測：將煙草乙烯不敏感突變體株系(C1、C2、C3、C4)及野生型(WT)的種子分2組(試驗(yàn)組和對照組)點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上，在正常條件下培養(yǎng)21 d，對照組繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)組放置在冰上(0 ℃)處理12 h，以DDS-11A電導(dǎo)儀測定低溫脅迫后植株葉片電解質(zhì)的電導(dǎo)率。根據(jù)電解質(zhì)滲漏率=L1/L2×100%進(jìn)行計(jì)算，其中L1為煮沸前的電導(dǎo)率，L2為煮沸冷卻后的電導(dǎo)率。試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對測定結(jié)果進(jìn)行方差分析(P<0.05)。

生理活性物質(zhì)檢測：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)含量采用紫外分光光度計(jì)檢測法測定，過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定，脯氨酸(Proline，Pro)含量采用酸性茚三酮法測定[15-16]。試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，經(jīng)SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值，并進(jìn)行方差分析及差異顯著性分析。

1.2.4 低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量qRT-PCR檢測 不同株系的煙草突變體及野生型在正常光照培養(yǎng)條件下生長21 d，置于0 ℃ (放置冰上)黑暗處理0，1，3，6，12，24 h后，將幼苗取出并洗凈培養(yǎng)基殘留物，液氮速凍并存于-80 ℃ 冰箱中留用。qRT-PCR所用儀器(Agileng，Mx3000P)、反應(yīng)體系(SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ，TaKaRa Bio Inc，Otsu，Japan)等參見Wang等[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 依據(jù)乙烯“三重反應(yīng)”篩選煙草突變體

煙草種子在附加乙烯前體物ACC (100 μmol/L)的MS培養(yǎng)基上無光照培養(yǎng) 6～7 d，通過分析幼苗的乙烯“三重反應(yīng)”，從2 000個M2的突變體株系中篩選得到了41個乙烯不敏感的煙草突變體株系，其中大部分突變體對干旱、低溫等逆境脅迫表現(xiàn)出明顯的抗性[4]。本試驗(yàn)選取其中4個株系(C1、C2、C3、C4)，對其抗冷性及抗冷機(jī)理進(jìn)行深入研究。

突變體4個株系(C1、C2、C3、C4)及野生型(WT)幼苗的乙烯“三重反應(yīng)”如圖1-A、1-B所示，在無光照條件下，附加ACC (100 μmol/L)的培養(yǎng)基上野生型煙草幼苗表現(xiàn)出典型的“三重反應(yīng)”特征：幼苗主根生長受到抑制，下胚軸縮短變粗，子葉形成特別的頂鉤；相比較，突變體株系的“三重反應(yīng)”特征不完整，特別是頂鉤彎曲(Aggregated apical hook)消失、下胚軸伸長不受抑制、主根有不同程度的生長等，簡稱為乙烯不敏感突變體(Ethylene insensitive mutant)。試驗(yàn)表明，這些突變體株系的M3、M4、M5后代均顯示相同的乙烯“三重反應(yīng)”特征，說明突變體性狀能夠穩(wěn)定遺傳[4]。

A.煙草幼苗生長狀況(0，100 μmol/L ACC；暗培養(yǎng)6 d)，bars=1 cm；B.煙草幼苗的下胚軸長度測量分析(P<0.05)，0，100 μmol/L ACC處理分別進(jìn)行了分析(柱形圖上方a,b,c, d等字母表示one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05)。

A.Growth status of tobacco seedlings(0，100 μmol/L ACC；6 days in darkness)，bars=1 cm；B.Hypocotyl length of tobacco seedlings.Lower letters above columns indicate significant differences in 0，100 μmol/L ACC treatment，respectively (one-way ANOVA，P<0.05).

圖1 煙草幼苗的乙烯“三重反應(yīng)”
Fig.1 Ethylene “triple response” of tobacco seedlings in darkness

圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)；*.P<0.05。圖8同。Data shown are means±SD(n=3)；*.P<0.05.The same as Fig.8.

2.2乙烯信號下游ERFs基因在煙草突變體中高水平表達(dá)

為了了解上述4個煙草乙烯反應(yīng)突變體中ERFs的基因表達(dá)，選取6個煙草ERF基因(NtERF1、NtERF2、NtERF3、NtERF4、NtERF5、NtERF6)分析了其內(nèi)源表達(dá)水平以及在低溫脅迫下的基因表達(dá)情況。如圖2所示，在沒有低溫脅迫的情況下，煙草乙烯不敏感突變體中的NtERF2、NtERF3、NtERF4、NtERF5和NtERF6的表達(dá)量顯著高于野生型 (圖2-B-F)。低溫處理(0 ℃)不同時(shí)間(1，3，6，12，24 h)后，野生型煙草中的NtERF1和NtERF5的表達(dá)量沒有顯著變化，而NtERF2、NtERF3、NtERF4和NtERF6的表達(dá)量顯著提高(圖2-B、C、D、F)。與野生型相比，突變體株系C1的NtERF1(圖2-A)、NtERF4(圖2-D)和NtERF5 (圖2-E)的表達(dá)量明顯提高；突變體株系C2、C3的NtERF2(圖2-B)和NtERF4 (圖2-D)的表達(dá)量明顯提高；突變體株系C4的NtERF3(圖2-C)、NtERF5(圖2-E)和NtERF6 (圖2-F)的表達(dá)量明顯提高。試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草突變體中高水平表達(dá)ERFs可能有助于提高植株的抗逆性。

2.3 煙草乙烯反應(yīng)突變體的抗冷性分析

對前期篩選獲得M3的 41個煙草乙烯不敏感突變體株系進(jìn)行抗冷性分析，與野生型相比，其中24個表現(xiàn)為較強(qiáng)的抗冷性。選取其中4個突變體株系(C1、C2、C3、C4)，進(jìn)一步觀察、測量低溫黑暗條件下幼苗的下胚軸伸長和主根生長，比較分析不同溫度條件下(4，8，15，25 ℃)黑暗培養(yǎng)的幼苗生長情況，結(jié)果表明(圖3-A)，正常溫度(25 ℃)條件下培養(yǎng)7 d，4個突變體株系的下胚軸長均短于野生型，而主根長度與野生型相比相差不大(圖3-A)；溫度降至15 ℃，處理14 d，突變體株系的下胚軸長度與野生型下胚軸長度稍優(yōu)于野生型，而突變體株系的主根長度顯著優(yōu)于野生型(圖3-B)；在8 ℃ 低溫條件下處理21 d，突變體株系的下胚軸及主根長度均顯著大于野生型(圖3-C)。當(dāng)溫度降至4 ℃ ，幼苗生長極其緩慢，無光照培養(yǎng)2個月后，所有突變體株系的下胚軸長度與部分突變體株系(C2、C3、C4)主根長度亦顯著優(yōu)于野生型(圖3-D)。

煙草幼苗黑暗條件下的下胚軸長度及主根長度測量分析 (A.25 ℃; B.15 ℃; C.8 ℃; D.4 ℃)。柱形圖上方a,b,c, d等字母表示one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05。

在低溫、光照條件下培養(yǎng)(16 h 光/8 h 暗、光強(qiáng)100 μmol/(m2·s)，煙草乙烯不敏感突變體株系的幼苗生長均較野生型生長狀況好，葉片肥大，主根粗壯發(fā)達(dá)，側(cè)根相對豐富，幼苗鮮質(zhì)量與根長均顯著優(yōu)于野生型(圖4)。而正常溫度(25 ℃)條件下，突變體與野生型長勢近似，鮮質(zhì)量及根長與野生型并無顯著差異(圖4-A-C)。

A～C.正常溫度(25 ℃)條件下煙草幼苗的生長狀況、鮮質(zhì)量及主根長度測量分析；D～F.低溫(15 ℃)條件下煙草幼苗的生長狀況、鮮質(zhì)量及主根長度測量分析；G～I(xiàn).低溫(8 ℃)條件下煙草幼苗的生長狀況、鮮質(zhì)量及主根長度測量分析；bar=1 cm，柱形圖上a,b,c,d等字母表示one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05。Growth status (A，D and G)，fresh weight (B，E and H) and primary root length (C，F(xiàn) and I) of tobacco seedlings under different temperature (A-C.25 ℃；D-F.15 ℃；G-I.8 ℃).Lower letters above columns indicate significant differences (one-way ANOVA,P< 0.05).

2.4 煙草乙烯反應(yīng)突變體抗性生理生化指標(biāo)的分析

細(xì)胞膜系統(tǒng)是遭受低溫傷害的首要部位，低溫處理對電解質(zhì)滲透率的影響可以作為植物抗冷性的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)。如圖5所示，25 ℃ 正常溫度條件下，野生型與突變體幼苗葉片的電解質(zhì)滲透率變化較小。在低溫(0 ℃)處理12 h后，4個煙草乙烯不敏感突變體株系的葉片的相對電導(dǎo)率顯著低于野生型的相對電導(dǎo)率(圖5)，說明煙草乙烯不敏感突變體植株具有較強(qiáng)的抗冷性。

另外，低溫(0 ℃)處理12 h后，各突變體的抗氧化酶(SOD和POD)活性均顯著高于野生型，其中突變體株系C3、C4較為突出(圖6-A、6-D)。低溫(0 ℃)處理后，各突變體的H2O2含量(以鮮質(zhì)量計(jì))均顯著低于野生型(圖6-B)；各突變體的CAT活性(以鮮質(zhì)量計(jì))均顯著高于野生型，其中突變體C2較為突出(圖6-C)。相比較，低溫(0 ℃)處理后，突變體的脯氨酸含量與野生型相差異較小，但整體仍高于野生型(圖6-F)。

不同小寫字母表示5%水平上差異顯著。Different letters represents significant difference at 0.05 level.

圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。柱形圖上方a,b,c, d等字母表示one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05。Error bars represent ±SD (n=3). Lower letters above columns indicate significant differences (one-way ANOVA,P< 0.05).

2.5 煙草乙烯反應(yīng)突變體中低溫誘導(dǎo)基因及其表達(dá)分析

為了進(jìn)一步了解煙草乙烯不敏感突變體中低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)情況，利用核苷酸同源序列比對的方法從煙草基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了3個煙草CBF基因(NtCBF1，NtCBF2，NtCBF3)和1個煙草COR基因(NtCOR47)的核苷酸序列，并對其編碼的氨基酸序列與擬南芥中的同源基因進(jìn)行了比較分析(圖7)；同時(shí)進(jìn)一步分析了其內(nèi)源表達(dá)水平以及在低溫脅迫下的基因表達(dá)水平，如圖8所示，低溫(0 ℃)處理使不同的冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)量均相對提高。但是未經(jīng)低溫處理，煙草突變體株系的冷誘導(dǎo)基因的相對表達(dá)量也普遍高于野生型。低溫處理(0 ℃)不同時(shí)間后(1，3，6，12，24 h)，冷誘導(dǎo)基因表達(dá)量均大幅度提高，其中突變體株系C1中所測定的4個冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)量在低溫處理6 h后明顯高于野生型，突變體株系C4中的NtCBFs(圖8-A-C)和NtCOR47(圖8-D)的表達(dá)量在低溫處理1 h時(shí)顯著高于野生型，突變體株系C2和C3中的NtCOR47的表達(dá)量在低溫處理3～24 h時(shí)明顯高于野生型。上述分析結(jié)果表明，不同突變體株系的冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)模式不同，冷誘導(dǎo)基因的高水平表達(dá)為其抗冷性提供了證據(jù)。

圖7 煙草NtCBFs與擬南芥AtCBFs基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系(A)及AtCOR47與AtCOR47的同源性比較(B)Fig.7 Phylogenetic comparison between NtCBFs and AtCBFs genes(A) & Homology comparison between NtCOR47 and AtCOR47(B)

圖8 低溫脅迫(0 ℃)對煙草乙烯不敏感突變體冷誘導(dǎo)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effect of cold stress (0 ℃) on the cold-induced gene expressions in tobacco ethylene insensitive mutants

3 討論

乙烯是只有碳和氫(C2H4)構(gòu)成的氣體小分子，但在植物生長發(fā)育過程中及逆境脅迫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。長期以來，相關(guān)研究人員利用模式植物擬南芥在復(fù)雜的乙烯反應(yīng)和信號傳導(dǎo)途徑的分子調(diào)控方面取得了重要進(jìn)展[17-18]。相比較，乙烯在植物應(yīng)答逆境脅迫反應(yīng)的生理機(jī)制以及分子機(jī)理方面研究較少[5]。本研究從煙草幼苗的乙烯敏感性入手，利用篩選獲得的乙烯不敏感突變體株系，分析其抗冷性以及相關(guān)的分子基礎(chǔ)，為利用生物技術(shù)開展分子育種提供了新思路。

通過對41個煙草乙烯不敏感突變體株系的抗冷性分析，其中24個表現(xiàn)為較強(qiáng)的抗冷性，說明植物的乙烯不敏感性與抗冷性密切關(guān)聯(lián)。這種關(guān)聯(lián)性在模式植物擬南芥中亦有報(bào)道，Shi等[7]發(fā)現(xiàn)擬南芥的乙烯不敏感突變體(etr1-1、ein4-1、ein3-1)對低溫脅迫有一定的抗性。本研究選取4個煙草突變體株系，深入分析了它們耐受低溫脅迫的生理基礎(chǔ)和分子機(jī)理。在如下幾個方面得到了抗冷性的支持證據(jù)：① 低溫(0 ℃)處理12 h后，4個煙草乙烯不敏感突變體株系的相對電導(dǎo)率顯著低于野生型的相對電導(dǎo)率，說明突變體株系的細(xì)胞膜系統(tǒng)對低溫傷害具有較強(qiáng)的抵抗性；②突變體株系在低溫脅迫下，抗氧化酶活性(POD、SOD)以及CAT活性都高于野生型，而過氧化氫含量則低于野生型，說明煙草乙烯不敏感突變體株系具有抵抗低溫脅迫的生理基礎(chǔ)，突變體植株比野生型更能適應(yīng)低溫環(huán)境；③低溫處理(0 ℃)不同時(shí)間后(1，3，6，12，24 h)，雖然不同突變體株系的基因表達(dá)模式不盡相同，但4個突變體株系的冷誘導(dǎo)基因(NtCBF1、NtCBF2、NtCBF3、NtCOR47)的表達(dá)量均呈現(xiàn)不同程度的高表達(dá)，為煙草乙烯不敏感突變體株系具有較強(qiáng)的抗冷性提供了直接的分子證據(jù)。

研究中發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)低溫處理的煙草乙烯不敏感突變體株系的冷誘導(dǎo)基因，其相對表達(dá)量也明顯高于野生型。在沒有低溫脅迫下，煙草乙烯不敏感突變體株系中大部分的乙烯信號傳導(dǎo)途徑中的下游基因ERFs的表達(dá)量也高于野生型。有理由相信，煙草乙烯不敏感突變體中較高水平的ERFs可能與相關(guān)冷誘導(dǎo)基因的高水平表達(dá)密切相關(guān)。突變體中，冷誘導(dǎo)基因與乙烯信號傳導(dǎo)途徑中基因的分子相互調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究。

乙烯信號傳導(dǎo)途徑中下游的ERFs是AP2 (Apetala2)/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的1個亞族，是植物特有的一類具有1個保守的ERF型DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子[19]。煙草中至少有239個ERF基因，包括10個亞族，其同源基因在擬南芥和水稻等植物中廣泛存在[20]。ERF轉(zhuǎn)錄因子除了結(jié)合GCC-box調(diào)控植物對病原生物的響應(yīng)外，還可以結(jié)合非GCC-box順式作用元件參與植物對低溫、干旱等非生物脅迫相關(guān)的應(yīng)答過程。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)證明，在煙草中過表達(dá)乙烯信號下游的ERFs能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對鹽、干旱及低溫脅迫的耐受性[8-13]。最近研究表明，煙草乙烯不敏感突變體中存在較高水平的ERFs，具有較強(qiáng)的耐旱能力[4]。本研究煙草乙烯不敏感突變體中存在較高水平的ERFs，與上述研究一致。

綜上所述，本研究利用遺傳誘變創(chuàng)制并篩選出煙草乙烯不敏感突變體株系，并對其較強(qiáng)的抗冷性在生理及分子機(jī)理方面進(jìn)行了深入分析，從細(xì)胞膜的電解質(zhì)滲透性、抗氧化酶活性以及突變體植株的冷誘導(dǎo)基因表達(dá)以及乙烯信號下游的ERFs轉(zhuǎn)錄水平的分析等諸多方面，闡釋了突變體抗冷性的分子基礎(chǔ)，為研究植物的乙烯反應(yīng)與非生物脅迫的關(guān)系提供了新證據(jù)，也為利用生物技術(shù)改良作物的抗逆性奠定了理論基礎(chǔ)。

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Chilling Tolerance Analysis of Ethylene Responsive Mutants in Tobacco

ZHAO Yuhang，LI Fengming，ZHANG Tao，HOU Xiaomin，YANG Hongbing，DONG Chunhai

(College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China)

To study the regulatory function of ethylene in plant stress tolerance，over 40 ethylene insensitive tobacco mutants were obtained from a genetic screen based on the typical seedling phenotype to ethylene in darkness，named "triple response"，and most of the mutants displayed chilling resistance.The present study chose 4 mutant strains for further analyses in their chilling tolerance，physiological basis，and cold-regulated gene expressions.Under low temperature (0 ℃) stress，the electrolyte permeability of the tobacco ethylene insensitive mutants was significantly lower than that of the wild type，while the activities of SOD，POD and catalase were higher than those of the wild type.Further study indicated that the cold-induced genes showed highly transcription level under low temperature (0 ℃) stress. And，the transcripts levels of the downstreamERFsin the ethylene signal transduction pathway in the mutants were altered in the tobacco mutants.These data provide a direct molecular evidence for the strong resistance of the tobacco ethylene insensitive mutants to chilling stress.This study not only provides a new evidence for the relationship between ethylene signaling and chilling stress，but also lays a foundation for the use of biotechnology to improve crop stress resistance.

Tobacco；Cold stress；Ethylene；Chilling tolerance；Mutant

2016-06-21

中國煙草總公司子課題(110201301005 JY-05)；中國農(nóng)科院煙草研究所子課題(2012JY-04-11)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370322；31571389)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2015GNC110012)

趙宇航(1991-)，男，山西太原人，在讀碩士，主要從事植物逆境生理研究。趙宇航、李鳳明、張弢為同等貢獻(xiàn)作者。

董春海(1962-)，男，山東兗州人，教授，博士，主要從事植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子調(diào)控研究。

S572.01

A

1000-7091(2016)06-0111-08

10.7668/hbnxb.2016.06.018