石桂英，白 琳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

長(zhǎng)期食用何首烏對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的影響

石桂英，白 琳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的探討長(zhǎng)期食用何首烏后，小鼠造血系統(tǒng)的變化。方法小鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組，喂飼正常飼料;何首烏飼料組，喂飼添加何首烏的飼料，10個(gè)月后，處死小鼠，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析外周血、脾臟、胸腺及骨髓中各種細(xì)胞。結(jié)果何首烏飼料組小鼠，脾臟B細(xì)胞增多，胸腺CD4+細(xì)胞增多，CD8+細(xì)胞減少;骨髓造血干細(xì)胞顯著減少，其中靜止期細(xì)胞增多，增殖分裂期細(xì)胞減少。結(jié)論長(zhǎng)期適量食用何首烏有助于減緩小鼠造血系統(tǒng)的衰老，維持造血系統(tǒng)穩(wěn)定。

何首烏;流式細(xì)胞術(shù);造血系統(tǒng)

何首烏(Fallopia multiflora)是蓼科植物何首烏的干燥塊根，是補(bǔ)益中藥，根據(jù)炮制方法不同，可分為何首烏和制何首烏。何首烏可以解毒、消癰、潤(rùn)腸通便，制何首烏有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨的作用［1］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，何首烏含有二苯乙烯苷、蒽醌和磷脂等多種有效成分，具有促進(jìn)造血功能，增強(qiáng)免疫功能，降血脂與抗動(dòng)脈粥樣硬化，保肝，延緩衰老等功能［2］。本研究主要探討長(zhǎng)期食用何首烏對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的影響。造血干細(xì)胞是各種血細(xì)胞的來(lái)源，其自我更新能力維持造血干細(xì)胞的數(shù)量，以及造血系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)［3］。本研究分析了造血系統(tǒng)各種細(xì)胞的變化、造血干細(xì)胞數(shù)量及功能的改變。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為10月齡C57BL/6J雌鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)環(huán)境為 SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(京)2014 -0029。

本研究中使用的主要設(shè)備為美國(guó)BD公司Aria I流式細(xì)胞儀。

1.2 中藥喂養(yǎng)

將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、何首烏飼料組，每組20只。正常對(duì)照組小鼠，飼料為小鼠SPF維持料;何首烏飼料組，飼料為 SPF小鼠維持料中按比例加入何首烏。藥物劑量按成人與小鼠之間劑量換算系數(shù)計(jì)算，每只小鼠每天攝食量為3 g，小鼠攝入何首烏的劑量為100 mg/kg獉d。按上述換算所得數(shù)據(jù)，在常規(guī)小鼠飼料中加入相應(yīng)劑量的何首烏配制成何首烏飼料。

1.3 流式分析

小鼠在給藥10個(gè)月后處死，采集樣品。樣品制備及染色方法同參考文獻(xiàn)［4］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)采用±s表示。組間資料分析采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 何首烏對(duì)成熟血細(xì)胞的影響

小鼠喂飼正常飼料或何首烏飼料10個(gè)月后處死，取外周血、骨髓、脾臟及胸腺，流式分析B細(xì)胞、粒細(xì)胞及CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏飼料組小鼠成熟B細(xì)胞增多，尤其脾臟中成熟B細(xì)胞比例顯著升高(圖1A);胸腺CD4+細(xì)胞顯著增多(圖1C)，而CD8+細(xì)胞顯著減少(圖1D)。骨髓及外周血中的B細(xì)胞、粒細(xì)胞、CD4+及CD8+細(xì)胞無(wú)顯著差異(圖1A、B、C、D)?？梢?jiàn)，長(zhǎng)期食用何首烏對(duì)脾臟B細(xì)胞及胸腺CD4+、CD8+細(xì)胞有影響。

圖1 外周血、骨髓、脾臟及胸腺中各種血細(xì)胞的比例Note.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，the control compared vs. theFallopia multifloragroup.Fig.1 Percentages of lymphocytes in the peripheral blood，bone marrow，spleen and thymus

2.2 何首烏對(duì)骨髓造血干、祖細(xì)胞的影響

成熟血細(xì)胞由造血干、祖細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，因此，我們分析了小鼠骨髓中干、祖細(xì)胞的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏飼料組小鼠骨髓中 Lin-SCA1+c-KIT+(LSK)細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(圖2A)，短期造血干細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖2C)，淋系共同祖細(xì)胞數(shù)量增多，但差別無(wú)顯著性(圖2E)，而長(zhǎng)期造血干細(xì)胞、多潛能祖細(xì)胞、髓系共同祖細(xì)胞、粒-單核祖細(xì)胞、巨核-紅系祖細(xì)胞差別無(wú)顯著性(圖2B、D、F、G、H)。

2.3 何首烏對(duì)造血干細(xì)胞功能的影響

衰老過(guò)程中，小鼠骨髓造血干細(xì)胞數(shù)量增加，但增加的是增殖活化的細(xì)胞［5］，因此，本研究中，分析了造血干細(xì)胞的增殖活化情況。結(jié)果表明，長(zhǎng)期食用何首烏的小鼠骨髓造血干細(xì)胞G0期細(xì)胞顯著增多，而G1及S/G2/M期細(xì)胞顯著減少(圖3A)。

圖2 骨髓造血干、祖細(xì)胞數(shù)量ote.＊＊P＜0.01，Control group vs.theFallopia multifloragroup.Fig.2 Amount of hematopoietic stem cells and progenitor cells in the bone marrow

圖3 造血干細(xì)胞周期及功能的變化Note.＊＊P＜0.01，control group compared with theFallopia multifloragroup.Fig.3 Changes of cell cycle and function of the LSK cells

為了研究造血干細(xì)胞的功能，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選長(zhǎng)期造血干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀(guān)察單個(gè)長(zhǎng)期造血干細(xì)胞的克隆形成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏飼料組小鼠長(zhǎng)期造血干細(xì)胞的克隆形成能力無(wú)顯著變化(圖3B)。

氧化應(yīng)激可以產(chǎn)生活性氧類(lèi)化合物(ROS)，這些化合物可以導(dǎo)致造血干細(xì)胞功能降低［5］。本研究中分析了造血干細(xì)胞中ROS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏飼料組顯著低于正常對(duì)照組(圖3C)。

3 討論

本研究應(yīng)用10月齡 C57BL/J小鼠為模型，喂飼正常小鼠飼料及添加何首烏飼料10個(gè)月后，分析兩組小鼠骨髓、脾臟、胸腺及外周血中多種血細(xì)胞的比例或數(shù)量，以及造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期、克隆形成能力及ROS水平。

已有研究表明，衰老過(guò)程中，小鼠淋系細(xì)胞生成能力降低而髓系細(xì)胞生成能力增強(qiáng)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，何首烏飼料組小鼠脾臟 B細(xì)胞增多，胸腺CD4+細(xì)胞增多，而 CD8+細(xì)胞減少，粒細(xì)胞則無(wú)顯著變化。這說(shuō)明在一定程度上，長(zhǎng)期食用何首烏可以改善小鼠淋系細(xì)胞生成能力。衰老小鼠造血干細(xì)胞數(shù)量增加，增殖活化的細(xì)胞增多，干細(xì)胞功能降低，ROS水平升高［5］。本研究中，何首烏飼料組小鼠造血干細(xì)胞減少，靜止期細(xì)胞增多，增殖期細(xì)胞減少，ROS水平降低。這說(shuō)明長(zhǎng)期食用何首烏有利于小鼠造血干細(xì)胞維持靜止?fàn)顟B(tài)，避免細(xì)胞過(guò)多增殖。

綜上可見(jiàn)，長(zhǎng)期適量食用何首烏有助于減緩小鼠造血系統(tǒng)的衰老，維持造血系統(tǒng)穩(wěn)定。

［1］高任龍，王會(huì)肖，李曉娜，等.何首烏的藥理毒理研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)藥，2015，37(2):42.

［2］蔡健.何首烏的功能成分與保健功效［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2009，(4):41-42，45.

［3］Kosan C，Godmann M.Genetic and epigenetic mechanisms that maintain hematopoietic stem cell function［J］.Stem Cells Int，2016(2016):Article ID 5178965.

［4］石桂英，白琳.枸杞對(duì)小鼠輻射損傷后造血系統(tǒng)修復(fù)的促進(jìn)作用［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2015，25(2):38-41，66.

［5］Chinn IK，Blackburn CC，Manley NR，et al.Changes in primary lymphoid organs with aging［J］.Semin Immunol，2012，24:309-320.

［6］Schultz MB，Sinclair DA.When stem cells grow old:phenotypes and mechanisms of stem cell aging［J］.Development，2016，143:3-14.

Effects of long-term consumption of Fallopia multiflora on mouse hematopoietic system

SHI Gui-Ying，Bai Lin
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo investigate the effects of long-term consumption ofFallopia multifloraon mouse hematopoietic system.MethodsForty 10-month old female C57BL/6J mice were equally divided into two groups at random，the control group fed with normal food，and the experimental group，given food with addedFallopia multiflora.After 10 month，the mice were sacrificed，and the peripheral blood，spleen，thymus and bone marrow cells were examined by flow cytometry.ResultsIn the mice fed withFallopia multiflora，the percentage of B cells in the spleen and CD4+cells in the thymus were increased，and CD8+cells in the thymus and bone marrow hematopoietic stem cells were decreased，among the bone marrow cells，G0 cells were increased，but G1 and G2/S/M cells decreased.ConclusionsLong-term proper consumption ofFallopia multifloracan delay the ageing of the hematopoietic system，and sustain its stability.

Fallopia multiflora;Flow cytometer;hematopoietic system;Bone marrow;Thymus;Mice

R-33

A

1671-7856(2016)12-0010-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.003

2016-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81200256);北京市自然基金項(xiàng)目(No:7132161)。

石桂英(1977-)，女，研究方向:干細(xì)胞與衰老。E-mail:guiying_shi77@163.com。

白琳(1984-)，研究方向:干細(xì)胞與衰老。E-mail:bailin49@163.com