趙 勇，師長(zhǎng)宏，趙 亞，辛智倩，劉佩娟，張彩勤，白 冰，白杰英，王 華，張 海

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071; 3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥 230022)

研究報(bào)告

利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建miRNA-29b1基因敲除小鼠

趙 勇1，師長(zhǎng)宏1，趙 亞1，辛智倩1，劉佩娟1，張彩勤1，白 冰1，白杰英2，王 華3，張 海1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071; 3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥 230022)

目的應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法針對(duì)miRNA-29b1基因設(shè)計(jì)一段sgRNA，sgRNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄后顯微注射至C57BL/6小鼠受精卵細(xì)胞。小鼠出生后取其基因組DNA進(jìn)行測(cè)序以鑒定基因型，同時(shí)取小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器研磨后提取總RNA，通過(guò)real-time PCR分析miRNA-29b1在這些臟器中的表達(dá)。結(jié)果設(shè)計(jì)了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并與Cas9一起進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄，顯微注射小鼠受精卵細(xì)胞后獲得miRNA-29b1基因突變小鼠。測(cè)序結(jié)果表明突變小鼠有兩種基因型，一種為10 bp的缺失突變;另一種為22 bp的缺失突變，同時(shí)伴有3 bp的插入突變。與野生型小鼠相比，基因突變小鼠心、肝、脾、肺、腎等組織中miRNA-29b1表達(dá)量下降明顯。結(jié)論應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建miRNA-29b1基因敲除小鼠。

CRISPR/Cas9;miRNA-29b1;基因敲除小鼠

在前期的研究中本課題組通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不僅發(fā)現(xiàn)miRNA-29b1在酒精肝中表達(dá)改變，而且觀察到miRNA-29b1影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，其機(jī)制可能是miRNA-29b1提高血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程［5］。由于酒精性肝纖維化對(duì)人危害大，目前尚無(wú)有效方法對(duì)其預(yù)防和治療，同時(shí)鑒于miRNA-29b1在酒精性肝損傷肝纖維化發(fā)病中的機(jī)制不明，本研究擬以CRISPR/Cas9技術(shù)敲除 C57BL/6小鼠中 miRNA-29b1基因，以研究miRNA-29b1基因在酒精性肝損傷及纖維化中功能。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，4～6周齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(軍)2012 -0007)，6～8周齡 ICR小鼠購(gòu)自于北京維通利華公司，兩種小鼠均飼養(yǎng)于屏障級(jí)設(shè)施。RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒及純化試劑盒購(gòu)自于 Ambion公司。sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京唯尚立德生物科技有限公司提供。Bbs I限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自于NEB公司，T4 DNA連接酶、dNTPs購(gòu)自于 TaKaRa公司。pX330質(zhì)粒由北京艾德摩公司饋贈(zèng)。小鼠基因組DNA提取試劑盒由成都嘉誠(chéng)生物科技有限公司提供，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自于天根生物公司。

1.2 sgRNA設(shè)計(jì)及重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù) Genbank上報(bào)道的小鼠 miRNA-29b1序列，將待敲除序列利用http://crispr.mit.edu網(wǎng)站進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)20 bp的sgRNA靶向序列(圖1，大寫(xiě)為miRNA-29b1成熟區(qū)序列，涂紅序列為PAM區(qū))。以此為依據(jù)，合成一對(duì)引物 (mir29b-pX330-F: CACCgaggaagctggtttcatatgg，mir29b-pX330-R: AAACccatatgaaaccagcttcctc)進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建。各取2 μL上下游引物，以水補(bǔ)齊至20 μL，95℃ 作用5min進(jìn)行退火，pX330質(zhì)粒Bbs I單切后回收，退火產(chǎn)物以T4連接酶克隆至pX330質(zhì)粒。

圖1 sgRNA設(shè)計(jì)Fig.1 Diagram of sgRNA design

1.3 sgRNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄及純化

幾年前，我贏得了《洛杉磯時(shí)報(bào)》夏季攝影比賽的冠軍，并開(kāi)始接觸國(guó)際攝影記者。住在越南會(huì)安時(shí)，我開(kāi)啟了自己的個(gè)人項(xiàng)目，我覺(jué)得每個(gè)攝影師都需要有自己的拍攝項(xiàng)目。

以上述pX330重組質(zhì)粒為模板，通過(guò)含T7啟動(dòng)子的上下游引物(mir29b-3at-F:tTAATACGACT CACTATAGGgaggaagctggtttcatatggG，mir29b-3at-R:A AAAgcaccgactcggtgc)進(jìn)行 PCR反應(yīng)克隆 sgRNA基因序列，sgRNA基因序列以體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、純化。同時(shí)以pX330質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)克隆Cas9基因，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 顯微注射及受精卵細(xì)胞移植

雌性C57BL/6小鼠超數(shù)排卵后收集受精卵細(xì)胞。Cas9和sgRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按2∶1比例混合，稀釋后使其終濃度含100 ng/μL的Cas9和50 ng/μL的sgRNA。以Eppendorf TransferMan NK2顯微操作裝置將上述混合物注入收集的受精卵細(xì)胞胞質(zhì)。注射后的受精卵細(xì)胞37℃培養(yǎng)2 h后移植到假孕的ICR母鼠。

1.5 敲除小鼠基因型鑒定

剪取出生1周新生小鼠尾巴，加入消化液后65℃作用30min進(jìn)行小鼠基因組DNA提取，具體提取方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取 100 ng基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)以鑒定小鼠基因型。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性3 min，98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃20 s，72℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán)。

1.6 Real time PCR鑒定miRNA-29b1在敲除小鼠體內(nèi)的表達(dá)

頸椎脫臼法處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎等組織勻漿后提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后以 Real time PCR進(jìn)行 miRNA-29b1表達(dá)檢測(cè)。cDNA合成引物為GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC CAGAGCCAACtaaacc，Real time PCR反應(yīng)上游引物GATCgctggtttcatatggtgg，下游引物 GTGCAGGGTCC GAGGT。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA及Cas9體外轉(zhuǎn)錄

以pX330重組質(zhì)粒為模板，sgRNA上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可得到大小約為120 bp的PCR產(chǎn)物(圖2A)，同時(shí)通過(guò) Cas9引物也可擴(kuò)增到4 200 bp的PCR產(chǎn)物(圖2B)。上述兩種PCR產(chǎn)物純化后在T7啟動(dòng)子介導(dǎo)下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后 OD260/280＞1.9，OD260/230＞2.0。

2.2 miRNA-29b1敲除小鼠基因型鑒定

注射sgRNA及Cas9 mRNA的小鼠受精卵細(xì)胞移植受體ICR小鼠后，獲得F0代首建鼠，F(xiàn)0代突變小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配，獲得F1代小鼠，F(xiàn)1代突變小鼠互交后獲得兩種基因型純合子小鼠。提取小鼠基因組DNA進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F0代有兩種基因型，一種是10 bp缺失突變;另一種是22 bp缺失突變，同時(shí)伴有3 bp插入突變。兩種基因型突變均發(fā)生在 miRNA-29b1序列成熟區(qū)(圖3)。

圖2 sgRNA及Cas9 PCR產(chǎn)物A:sgRNA PCR產(chǎn)物 B:Cas9 PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR product of the sgRNA and Cas9

圖3 miRNA-29b1敲除小鼠基因型Fig.3 Genotype of the miRNA-29b1knockout mice

2.3 miRNA-29b1在敲除小鼠體內(nèi)表達(dá)

取F2代純合子小鼠的心、肝、脾、肺、腎等組織，勻漿后提取細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后以 real-time PCR進(jìn)行分別檢測(cè)miRNA-29b1在上述臟器中的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，與野生型 C57BL/6小鼠相比，miRNA-29b1在F2代純合子小鼠心、肝、脾、肺、腎等組織中的表達(dá)明顯下降，表明成功構(gòu)建miRNA-29b1基因敲除小鼠。

3 討論

CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來(lái)的獲得性免疫防御機(jī)制。在這一系統(tǒng)中，crRNA通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA結(jié)合形成雙鏈 RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)切斷雙鏈DNA［7］。在基因組編輯過(guò)程中，tracrRNA和 crRNA可以融合成為1條具有靶向作用的RNA(sgRNA)表達(dá)，該 sgRNA同樣可以起到靶向剪切的作用。CRISPR/Cas9的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，對(duì)基因組的效率高，需要對(duì)某一個(gè)靶位點(diǎn)編輯的時(shí)候，只需要表達(dá)相應(yīng)的sgRNA即可，不需要對(duì)Cas9核酸酶進(jìn)行改造，它可對(duì)任何物種的基因組進(jìn)行高效率的定向編輯［8］。本研究中我們體外合成一條 sgRNA，該sgRNA具有良好的靶向作用，可引導(dǎo)Cas9蛋白發(fā)揮核酸酶作用，在特定的PAM區(qū)上游對(duì)miRNA-29b1進(jìn)行定向編輯。sgRNA和Cas9轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物注射供體小鼠受精卵細(xì)胞后，共得到33只F0代小鼠，測(cè)序結(jié)果表明9只小鼠miRNA-29b1基因發(fā)生缺失突變，陽(yáng)性率為27%，明顯高于ES細(xì)胞打靶技術(shù)，由此證明CRISPR/Cas9技術(shù)是一個(gè)簡(jiǎn)單、高效的基因編輯工具，可用于基因修飾動(dòng)物研究。

miRNA-29家族中各個(gè)成員序列高度同源，僅有2～3個(gè)主要位點(diǎn)有所不同。miRNA-29a和miRNA-29c均含有22個(gè)核苷酸，二者之間僅5’端的第10個(gè)核苷酸不同;miRNA-29b含有23個(gè)核苷酸，與miRNA-29a/c不同的是，miRNA-29b的3’端具有AGUGUU序列，該序列具有核定位作用，因此miRNA-29b主要位于細(xì)胞核［9］。miRNA-29序列的特殊性決定各個(gè)成員具有不同的生物學(xué)功能，miRNA-29a/b1與某些疾病的發(fā)生有關(guān)，而miRNA-29b2/c與免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)相關(guān)。CCl4肝纖維化小鼠模型miRNAs表達(dá)譜結(jié)果顯示有31種miRNAs表達(dá)發(fā)生變化，miRNA-29家族表達(dá)減少，其中miRNA-29b下降最為顯著，而在正常肝組織中 miRNA-29b高表達(dá)，提示 miRNA-29b可能與肝纖維化疾病有關(guān)［10］。miRNA-29b1在多種器官纖維化的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，研究表明 TGF-β1可下調(diào) miRNA-29b1表達(dá)，減輕其對(duì) TGF-β1/Smad信號(hào)通路的抑制作用，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生［11］。這提示我們?nèi)绻贸齧iRNA-29b1基因后，纖維化發(fā)生時(shí)間會(huì)提前，纖維化發(fā)生程度可能會(huì)加重，因此通過(guò)敲除miRNA-29b1基因復(fù)制酒精性肝纖維化動(dòng)物模型可克服以往動(dòng)物模型的缺點(diǎn)。本研究構(gòu)建的miRNA-29b1基因敲除小鼠，將為酒精性肝纖維化提供良好的動(dòng)物模型，尤其對(duì)研究miRNA-29b1在酒精性肝纖維化發(fā)病機(jī)制提供良好的研究條件。

［1］Iizuka M，Ogawa T，Enomoto M，et al.Induction of microRNA-214-5p in human and rodent liver fibrosis［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2012，5(1):12.

［2］Kida K，Nakajima M，Mohri T，et al.PPARalpha is regulated by miR-21 and miR-27b in human liver［J］.Pharm Res，2011，28(10):2467-2476.

［3］Gui J，Tian Y，Wen X，et al.Serum microRNA characterization identifies miR-885-5p as a potential marker for detecting liver pathologies［J］.Clin Sci(Lond)，2011，120(5):183-193.

［4］Hyun J，Choi S S，Diehl A M，et al.Potential role of Hedgehog signaling and microRNA-29 in liver fibrosis of IKKbeta-deficient mouse［J］.J Mol Histol，2014，45(1):103-112.

［5］Mott JL，Kobayashi S，Bronk SF，et al.mir-29 regulates Mcl-1 protein expression and apoptosis［J］.Oncogene，2007，26 (42):6133-6140.

［6］Zhu HQ，Li Q，Dong LY，et al.MicroRNA-29b promotes highfat diet-stimulated endothelial permeability and apoptosis in apoE knock-out mice by down-regulating MT1 expression［J］.Int J Cardiol，2014，176(3):764-770.

［7］Terao M，Tamano M，Hara S，et al.Utilization of the CRISPR/ Cas9 system for the efficient production of mutant mice using crRNA/tracrRNA with Cas9 nickase and FokI-dCas9［J］.Exp Anim，2016.65(3):275-283.

［8］Dang Y，Jia G，Choi J，et al.Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency［J］.Genome Biol，2015，16:280.

［9］Hwang HW，WentzelEA，MendellJT.A hexanucleotide element directs microRNA nuclear import［J］.Science，2007，315(5808):97-100.

［10］Roderburg C，Urban GW，Bettermann K，et al.Micro-RNA profiling reveals a role for miR-29 in human and murine liver fibrosis［J］.Hepatology，2011，53(1):209-218.

［11］Cushing L，Kuang PP，Qian J，et al.miR-29 is a major regulator of genes associated with pulmonary fibrosis［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，45(2):287-294.

Construction of miRNA-29b1 knockout mice based on CRISPR/Cas9 technology

ZHAO Yong1，SHI Chang-hong1，ZHAO Ya1，XIN Zhi-qian1，LIU Pei-juan1，ZHANG Cai-qin1，BAI Bing1，BAI Jie-ying2，WANG Hua3，ZHANG Hai1
(1.Laboratory Animal Center，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China; 2.Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071; 3.Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022)

ObjectiveTo construct miRNA-29b1 gene knockout mice based on CRISPR/Cas9 technology.MethodsTo design and synthesize sgRNA according to the miRNA-29b1 sequence in Genbank.sgRNA and Cas9 were transcribed to RNA in vitro，these RNA were then microinjected into zygotes of C57BL/6 mice.After mouse birth，the genome DNA was extracted and sequenced to identify its genotype;meanwhile，real-time PCR was used to assay the expression of miRNA-29b1 in the heart，liver，spleen，lung and kidney of mutated mice.ResultA 20 bp sgRNA targeted on miRNA-29b1 was synthesized and transcribed to RNA with Cas9.After microinjection，miRNA-29b1 gene-mutated mice were obtained.The sequencing results showed that there were two types of genotype for the mutated mice，one was 10 bpdeletion，and another was 23 bp deletion accompanied with a 3 bp insertion.Compared with the wild-type mice，the expression of miRNA-29b1 in the heart，liver，spleen，lung and kidney was reduced significantly.ConclusionsmiRNA-29b1 gene knockout mice are constructed successfully by using CRISPR/Cas9 technology.

CRISPR/Cas9;miRNA-29b1;Gene knockout mice

R-33

A

1671-7856(2016)12-0001-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.001

2016-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目(NO.81522009);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(NO.8137257，81272385);軍隊(duì)重點(diǎn)項(xiàng)目(NO.BWS14J058)。

趙勇(1984-)，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè):動(dòng)物模型。E-mail:zhaoyong8@aliyun.com。

張海(1971-)，男，副教授，研究方向:動(dòng)物模型。E-mail:hzhang@fmmu.edu.cn.王華(1978-)，男，教授，研究方向:肝損傷與修復(fù)。E-mail:wanghua@ahmu.edu.cn。