趙 娜 ， 黃一鳴, ， 潘晶晶, ， 雍 慧, ， 曹福源 ， 張艷淑 ， 姚 林, ， 李 爽

(1.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 ， 河北 唐山 063000； 2.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 ， 河北 唐山 063000)

小鼠諾如病毒(murinenorovirus，MNV)是一種引起免疫缺陷小鼠腦炎、腦膜炎、肝炎、腸炎和肺炎的傳染性病原，與人類諾如病毒密切相關(guān)[1]。2003年該病毒從轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT-1)以及重組體激活基因2(RAG-2)缺陷(RAG-2-/-/STAT-1-/-)小鼠中被首次發(fā)現(xiàn)[2]，之后美國(guó)、加拿大、日本等國(guó)的實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)均監(jiān)測(cè)到該病毒，并發(fā)現(xiàn)MNV是感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要病原體，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)此病毒易感[3]。MNV能通過接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，彌補(bǔ)了人類諾如病毒不能通過細(xì)胞培養(yǎng)方式增殖的缺憾，可用于模擬人類諾如病毒的感染和復(fù)制機(jī)制[4]。本文對(duì)MNV的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷學(xué)方法等進(jìn)行綜述，為該病的防控提供理論依據(jù)。

1 病毒學(xué)特征

諾如病毒(Norovirus，NoV)屬杯狀病毒科(Calicivirus)，諾如病毒屬，無囊膜，二十面體對(duì)稱，核酸為單鏈正股RNA，是導(dǎo)致急性胃腸炎暴發(fā)的重要病原體之一。據(jù)報(bào)道MNV是目前首個(gè)能夠在細(xì)胞復(fù)制的諾如病毒，可在小鼠巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞體外感染和復(fù)制[5]。

諾如病毒基因全長(zhǎng)約7.3～7.8 kbp，含3個(gè)穩(wěn)定的鏈環(huán)結(jié)構(gòu)，具有5′端連接蛋白和3′端poly(A)尾巴。研究表明：3′端poly(A)對(duì)于RNA合成是非必需的。MNV基因組包含有3個(gè)開放閱讀框架(open reading frames，ORFs)，命名為ORF1、ORF2和ORF3[6]。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括2C螺旋酶、3C蛋白酶和3D聚合酶基序。ORF2和ORF3則分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白衣殼蛋白VP1和堿性蛋白VP2，其中VP1基因是諾如病毒屬成員基因分型的依據(jù)。MNV各ORF間有部分基因重疊，但不同病毒株的ORF1和ORF2重疊基因的堿基個(gè)數(shù)存在差異[7]。此外，Thackray發(fā)現(xiàn)在MNVORF2中存在ORF4，但不在同一閱讀框[8]。

MNV ORF1編碼的氨基酸序列比ORF2更加保守。這是因?yàn)镺RF1編碼的聚合酶蛋白發(fā)生突變更有可能產(chǎn)生對(duì)病毒本身有害的無功能蛋白，而ORF2編碼的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生有害突變的可能性小，并且可能作為逃避宿主免疫監(jiān)視的一種方式[9]。衣殼蛋白VP1內(nèi)部S區(qū)形成二十面體殼，P區(qū)形成衣殼蛋白的突出部分，因此S區(qū)更加保守，而P區(qū)作為主要抗原位點(diǎn)比S區(qū)更加暴露于宿主免疫系統(tǒng)的選擇性壓力之下[10]。Bailey等發(fā)現(xiàn)部分毒株在VP1的第296位點(diǎn)發(fā)生了谷氨酸的突變，推測(cè)該突變是適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的結(jié)果。而原始株MNV1的賴氨酸殘基是免疫功能不全宿主在特定的選擇壓力下的結(jié)果[11]。

2 流行病學(xué)

MNV在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。Rodrigues等[12]對(duì)巴西地區(qū)的359只小鼠進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，MNV的感染率為38.16%。Mumphrey等[13]用血清學(xué)的方法檢測(cè)美國(guó)和加拿大地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠諾如病毒感染率約為22.1%，是細(xì)小病毒感染率的9倍。對(duì)歐洲地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠MNV感染情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MNV感染率高達(dá)58%～64%[14]。2012年，日本報(bào)道野生嚙齒類動(dòng)物中MNV感染率為14.9%[15]。在我國(guó)，袁文等用熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)344份小鼠盲腸內(nèi)容物，陽性率29.94%[16]。馬暢等[17]對(duì)江蘇地區(qū)MNV的感染情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抽檢的實(shí)驗(yàn)小鼠MNV感染率為13.3%,考慮MNV可能在同一設(shè)施內(nèi)傳播。MNV已成為目前實(shí)驗(yàn)小鼠感染率較高的一種病毒。

3 臨床癥狀

對(duì)于不同的免疫缺陷動(dòng)物，感染諾如病毒后癥狀有一定的差異。先天性免疫系統(tǒng)應(yīng)答因子缺陷的小鼠，如STAT-1-/-小鼠、I型和II型干擾素受體同時(shí)缺陷(IFNαβ R-/-/IFNγR-/-)小鼠發(fā)生致死性感染，表現(xiàn)為體重減輕、豎毛和拱背等臨床癥狀，但RAG-1-/-/RAG-2-/-小鼠感染MNV后仍能存活，在持續(xù)感染后90天仍能檢測(cè)到病毒存在[18]，表明在某些免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)MNV能夠持續(xù)感染。

免疫活性小鼠和大多數(shù)免疫缺陷小鼠感染MNV后不表現(xiàn)臨床癥狀和病理變化，但該病毒疑似能夠改變實(shí)驗(yàn)小鼠的表型，主要是引起炎癥和免疫反應(yīng)。動(dòng)物諾如病毒很少引起嚴(yán)重的臨床癥狀，只有鼠類諾如病毒會(huì)引起宿主體內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的組織病理性損傷。在免疫功能不全的動(dòng)物中諾如病毒常引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀，如可使新生犢牛的腸胃炎癥狀加重或復(fù)雜化。

4 病理變化

MNV能夠引起RAG-2-/-/STAT-1-/-小鼠死亡，臨床癥狀表現(xiàn)為腦炎、腦血管炎、肺炎和肝炎等。試驗(yàn)鼠接種病毒5周后，其脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和空腸中能檢測(cè)到MNV-Ⅰ型的RNA不同基因品系的免疫缺陷的小鼠感染MNV-Ⅰ型后出現(xiàn)全身性感染以及不同組織(肺、肝、腹膜和胸膜腔)的炎性癥狀[13]。免疫機(jī)能健全的小鼠感染MNV-Ⅰ型后僅表現(xiàn)一定程度的組織病理變化。因此，可以認(rèn)為該病僅發(fā)生于先天性免疫系統(tǒng)缺乏的小鼠中。而在北美地區(qū)分離到的新型MNV(Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型)與Ⅰ型毒株在致病性上存在一定差異，將這3種MNV毒株和MNV-Ⅰ型毒株對(duì)免疫功能正常的小鼠進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MNV-Ⅰ型毒株的感染過程短暫，新發(fā)現(xiàn)的3種毒株感染后小鼠排毒期長(zhǎng)，而且呈現(xiàn)慢性組織感染[19]。由此可以推斷其他的人類諾如病毒毒株或動(dòng)物諾如病毒毒株同樣會(huì)引起這些類似癥狀，從而可能導(dǎo)致病毒傳播和疾病暴發(fā)。

5 診斷

目前MNV的診斷方法主要為分子生物學(xué)方法和血清學(xué)方法。

RT-PCR已廣泛應(yīng)用于諾如病毒的檢測(cè)，成為諾如病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性及特異性均較好。但由于杯狀病毒科基因組高度變異性，學(xué)者選擇多種不同引物對(duì)MNV進(jìn)行檢測(cè)。基于小鼠諾如病毒與人類諾如病毒序列的分析，保守性的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列常作為檢測(cè)的目的片段。隨著MNV全基因組序列的測(cè)定和分析，MNV的5′端和ORF1-ORF2連接位置存在的32 bp和64 bp的保守序列，ORF4和3′非編碼區(qū)間47 bp和73～83 bp的保守序列，為PCR診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。Kitajima等建立了適合于本地區(qū)MNV檢測(cè)的巢式RT-PCR，比常規(guī)的PCR敏感性更高，而建立的熒光定量RT-PCR方法將病毒檢測(cè)定量化[20]。袁文等建立了一種結(jié)合內(nèi)標(biāo)的熒光定量RT-PCR方法，其檢測(cè)靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10倍，比病毒分離高100倍，能有效地監(jiān)控假陰性的出現(xiàn)，適合用于MNV日常監(jiān)測(cè)、臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查[16]。高潔等[21]成功建立MNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，并對(duì)北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠MNV感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示陽性率為39.3%。

血清學(xué)方法主要為ELISA方法。Xiang等[22]利用表達(dá)的重組蛋白VP1建立ELISA方法具有較好的特異性和敏感性，對(duì)中國(guó)的600份小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MNV陽性率為11.67%，其中商品化實(shí)驗(yàn)小鼠陽性率(30.97%)遠(yuǎn)高于非商業(yè)化銷售小鼠。

6 預(yù)防和控制

設(shè)施消毒是預(yù)防MNV在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和研究設(shè)施中傳播的重要環(huán)節(jié)。MNV在常溫下尤其是在潮濕的糞便中十分穩(wěn)定，但利用巴氏消毒法(63 ℃～72 ℃)幾秒鐘病毒即可被滅活[23]。電離(紫外線)和非電離(伽瑪射線)照射同樣可滅活病毒[24]。400 MPa高壓處理5 min可使MNV活力降至無檢出水平。與物理滅活方法相比，化學(xué)處理對(duì)MNV的效果較差。MNV在pH值2～10具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，次氯酸鹽濃度需達(dá)到300 μg/mL才能滅活病毒，氯仿、70%乙醇、氟化物和Vertrel清洗劑對(duì)病毒在很大程度上是無效的[25]。利用PCR方法對(duì)高壓后的墊料、飼料和飲水進(jìn)行定期檢測(cè)有助于控制該病毒的傳播。在飼養(yǎng)管理方面，屏障內(nèi)工作人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行屏障生產(chǎn)設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，外購(gòu)動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物設(shè)施前要了解動(dòng)物健康情況，嚴(yán)禁有流行病史動(dòng)物進(jìn)入。另外，還應(yīng)該避免野生小鼠、蚊蠅和昆蟲進(jìn)入動(dòng)物房。動(dòng)物飼養(yǎng)人員要經(jīng)過對(duì)皮膚表面和服裝消毒之后方可進(jìn)入動(dòng)物房?jī)?nèi)，禁止外來人員進(jìn)入。

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