鄭 歡趙春艷羅紅秀牛曉藝張榆敏

(1.重慶市綦江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,重慶 401420; 2.重慶市墊江縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所,重慶 408300)

旋毛蟲的幾種檢驗檢疫技術(shù)

鄭 歡1趙春艷2羅紅秀1牛曉藝1張榆敏1

(1.重慶市綦江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,重慶 401420; 2.重慶市墊江縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所,重慶 408300)

旋毛蟲病是一個全球性的疾病，可以導(dǎo)致人和多種動物患病。世界各國均把屠宰動物的旋毛蟲作為首檢、必檢和強(qiáng)制性檢疫的項目。本文就旋毛蟲的幾種檢驗檢疫技術(shù)作簡要的概述。

旋毛蟲 檢驗檢疫

1 目檢法

由于旋毛蟲感染動物后，大約21d～7個月就會形成鈣化，這樣只要用肉眼就能將其檢出。該方法一般是直接在肉尸的左右橫膈肌腳采取不少于30g的肉樣，然后撕去肌膜，將肌肉拉平，觀察肌肉纖維的表面。若發(fā)現(xiàn)有半透明露滴狀或乳白色、黃白色點狀物，即可判定該豬肉為旋毛蟲肉。這種方法的檢出率較高，但是需要在自然光線好的條件下進(jìn)行，而且這種方法不宜單獨應(yīng)用，因為其檢出率的高低取決于檢驗人員的經(jīng)驗，漏檢率也相對較高，有時可以達(dá)到80.5%。所以只能用作初次篩選，結(jié)合顯微鏡檢查可以有效地提高旋毛蟲的檢出率。

2 鏡檢法

鏡檢是檢驗旋毛蟲較為傳統(tǒng)的方法。主要步驟是從胴體兩側(cè)的橫膈膜肌腳部各采樣一塊不小于50～100 g的肌肉，然后用剪刀順著肌肉纖維在樣肉的不同部位剪取12個麥粒大小的肉粒（2塊肉樣共剪取24粒）。特別剪取呈露滴狀或呈乳白色脂肪樣外觀的小點病灶，然后將肉粒依次貼附于玻片上，蓋上另一玻片。用力壓扁，然后將壓片置于50～70倍的低倍顯微鏡下觀察，要從玻片的一端開始直到另一端為止，以減少漏檢率。當(dāng)檢查形成包囊的旋毛蟲時，可以發(fā)現(xiàn)一條或多條毛狀蜷曲于充滿透明液體的囊腔中。若是沒有形成包囊的旋毛蟲，則會發(fā)現(xiàn)蟲體在肌纖維之間呈直桿狀或逐漸蜷曲狀態(tài)，或蟲體被擠于壓出的肌漿中。若是鈣化的旋毛蟲，則需要向肉片中稍加10%的鹽酸溶液，待1 min后，再進(jìn)行觀察。該方法的優(yōu)點是不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，操作簡便，不需要很專業(yè)的人才，而且直觀性強(qiáng)，容易定性和定量。但是也有一定的缺點，那就是漏檢率相對較高，僅能檢出1g肌肉含3條以上幼蟲的樣品。并且此法需要的工作量大，無法跟進(jìn)屠宰的速度，同時容易造成檢疫員眼睛疲勞。

3 人工消化法

該方法是利用胃蛋白酶將肌肉組織消化后，使活的旋毛蟲幼蟲從囊包中釋放出來。由于旋毛蟲鏡的敏感性低以及不能檢出所有的旋毛蟲的缺點，所以國際旋毛蟲病委員會推薦使用消化法作為旋毛蟲檢疫的首選方法。消化法的主要操作流程是先以5～10頭豬為1組，編號，采取膈肌數(shù)克；然后將肉樣置于攪拌器中攪碎，加入含有1%鹽酸的0.33%胃蛋白酶溶液，置于43℃的恒溫中消化30min以上，直到肌肉被完全消化為止；用80目的篩子過濾至分液漏斗中，并用溫水沖洗篩子，沉淀后將漏斗中的液體放到離心管中再沉淀，最后吸出上清液，并觀察位于離心管底部的旋毛蟲幼蟲。消化法具有特異性強(qiáng)，檢出率高，直觀性強(qiáng)，既能定性又能定量、穩(wěn)定可靠、操作可自動化、成本低等優(yōu)點，適合于生前診斷或宰前檢疫。缺點是檢查過程中需要的試劑較多，而且操作過程比較煩瑣，檢測過程花時間長。

4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELlSA）

SPA-ELISA的原理是根據(jù)葡萄球菌蛋白A（SPA）能與人和多種哺乳動物的IgG結(jié)合，有較高的敏感性，而且可以不受種屬特異性的限制，并且具有制備容易、性質(zhì)穩(wěn)定、易純化，使用更趨方便等優(yōu)點，所以可用以代替間接ELISA中的酶標(biāo)第二抗體來檢測旋毛蟲的感染情況。DOT-ELISA是以纖維素薄膜為固相載體，孔徑大約為0.2～0.4μm，將抗原或抗體用大頭針蘸取印滴吸附住纖維膜表面，然后通過相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)以及加入底物后呈現(xiàn)出肉眼可見的顏色斑點。這種方法的優(yōu)點是敏感性高、被檢樣品用量少，而且不需要昂貴的儀器，只需肉眼即可檢出等，但是它的缺點是難以做到定量檢測，而且只憑肉眼觀察來判定結(jié)果，存在很大的主觀性。

5 快速免疫層析法（GlCA）

該方法的原理是先選取一個固相層析作為載體，然后在層析材料上包被相應(yīng)的抗原，采用膠體金技術(shù)將處理過的制劑吸附在試紙條上，檢測被檢血清中的相應(yīng)抗體。如果抗原、抗體相對應(yīng)，則發(fā)生高特異的免疫親和反應(yīng)，免疫復(fù)合物被截留集聚在一定區(qū)域（檢測帶），通過膠體金而得到肉眼直觀的顯色帶，即可判定檢測結(jié)果。根據(jù)實驗結(jié)果表明該方法的特異性和敏感性與ELISA基本相同，但是與ELISA相比具有操作簡便、不需特殊儀器設(shè)備、檢測結(jié)果可長期保存等優(yōu)點，是一種較理想的旋毛蟲病免疫學(xué)診斷方法，尤其適合于在基層單位和現(xiàn)場應(yīng)用。對于生豬的肉品衛(wèi)生檢驗尤其適用，是一門全新的實用技術(shù)，可以大面積的推廣應(yīng)用。

6 分子生物學(xué)檢驗

目前，已經(jīng)開發(fā)出了多種可用于旋毛蟲檢驗的分子生物學(xué)方法。包括有PCR檢測、實時熒光PCR檢測以及基因芯片技術(shù)等。宋銘忻等根據(jù)旋毛蟲隔離種線粒體Ls-rRNA基因設(shè)計引物和TaqMan MGB探針，建立了實時熒光PCR可以同時檢測各旋毛蟲隔離種的方法。該實驗證明了該方法具有穩(wěn)定性好、敏感性強(qiáng)、通量高等特點，為旋毛蟲的檢驗檢疫以及以后制作試劑盒提供良好的實用技術(shù)和研究基礎(chǔ)。張媛等根據(jù)提取旋毛蟲SB2基因的可變區(qū)設(shè)計引物及探針，點樣于玻片制成基因芯片。該方法適應(yīng)于大規(guī)模、高通量的檢測要求，尤其適應(yīng)于寄生蟲病現(xiàn)場的檢測及監(jiān)測，具有廣泛的應(yīng)用前景。不過這些分子生物學(xué)方法目前還只停留在實驗室階段，想要在實際工作中應(yīng)用還有很長的一段路。

[1] 甘孟侯，楊漢春.中國豬病學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：410-413.