葉俊賢，馮宇，陳瑞愛(ài)，丁家波*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

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布魯氏菌S19疫苗應(yīng)用及研究進(jìn)展

葉俊賢1,2，馮宇1，陳瑞愛(ài)2*，丁家波1*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患病，該病對(duì)畜牧業(yè)和人類健康均構(gòu)成嚴(yán)重威脅，使用疫苗免疫是防控布病的重要措施之一。光滑型牛種布魯氏菌19(S19)活疫苗是世界上第一個(gè)被廣泛應(yīng)用且效果良好的布病疫苗，至今為止仍是使用最廣泛的疫苗之一。本文主要從應(yīng)用情況及目前研究進(jìn)展兩大方面對(duì)S19疫苗進(jìn)行概述，以期為日后使用該疫苗預(yù)防布魯氏菌病提供借鑒及為疫苗研究提供思路。

布魯氏菌；布魯氏菌??；S19疫苗

布魯氏菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)感染機(jī)體而引起的人獸共患傳染病。布魯氏菌是革蘭氏陰性、兼性胞內(nèi)寄生菌，根據(jù)宿主特異性、生化特性和抗原組成目前大致分為10個(gè)生物種，包含20個(gè)生物分型，其中常見且危害性較大的是羊種、牛種和豬種[1]。布魯氏菌可感染多種野生動(dòng)物和家畜，主要侵害機(jī)體淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，感染后能夠?qū)е履感蟛辉胁挥?、早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降等；公畜則出現(xiàn)睪丸炎、機(jī)體消瘦等癥狀[2]。人類可以通過(guò)接觸受感染動(dòng)物及受污染物品而感染。人感染布魯氏菌后，表現(xiàn)出波浪熱、多汗、全身乏力、關(guān)節(jié)疼痛甚至變形、睪丸腫大、神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)功能障礙等，病情較長(zhǎng)且反復(fù)，給病人帶來(lái)極大痛苦和傷害[3]。該病一方面給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，另一方面對(duì)人類健康和社會(huì)公共衛(wèi)生安全有極大的隱患。因此，在布病流行的國(guó)家，布病防控及消除工作一直是公共健康計(jì)劃的重要內(nèi)容。另外，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)動(dòng)物布病發(fā)病率在2005-2007年基本保持穩(wěn)定，但2008年以后發(fā)病率開始大幅上升，2009年的發(fā)病數(shù)已達(dá)到2000年的18.6倍[4]，2011年全國(guó)報(bào)告的新發(fā)病例數(shù)比2010年增加了28.8%[5]。數(shù)據(jù)顯示目前我國(guó)布病疫情形勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻，有效防控布病刻不容緩。

帶菌的動(dòng)物是引起布病發(fā)生的主要傳染源。因此，加強(qiáng)動(dòng)物布病的防控勢(shì)在必行，這對(duì)防控人間布病同樣具有重要的意義。在正確診斷和捕殺患病動(dòng)物、有效切斷傳播途徑的基礎(chǔ)上，接種疫苗是公認(rèn)的能夠降低動(dòng)物布病發(fā)生和傳播的最實(shí)際有效的方法之一。牛種布魯氏菌19 (B.abortusstrain19，S19)疫苗是世界上第一個(gè)被廣泛使用的有效預(yù)防布病的動(dòng)物疫苗[6]。20世紀(jì)50年代，我國(guó)從前蘇聯(lián)引進(jìn)S19疫苗株[7]，用于養(yǎng)殖業(yè)中布魯氏菌的防治，迄今為止在我國(guó)已使用60多年，該疫苗株為我國(guó)有效地防控牛布病做出了卓越貢獻(xiàn)。本文將對(duì)S19疫苗的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 疫苗概況

S19疫苗株是光滑型牛種布魯氏菌弱毒活菌株，最初的S19疫苗株是John Buck在1923年從新澤西奶牛場(chǎng)的牛奶樣品中分離，并在實(shí)驗(yàn)室條件下，傳代培養(yǎng)一年后得到的弱毒光滑型突變株。由于早期該疫苗使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)能導(dǎo)致部分懷孕母畜流產(chǎn)以及人的感染，安全性較低，在美國(guó)被禁止使用。目前廣泛使用的S19疫苗株是1956年由美國(guó)科學(xué)家篩選得到的對(duì)赤蘚醇ery基因敏感的缺失株，安全性較初期疫苗有所提高[8]。

S19疫苗于20世紀(jì)30年代起便在世界范圍內(nèi)被用于預(yù)防牛布魯氏菌病。在美國(guó)，該疫苗一直到20世紀(jì)90年代中期，才逐漸被粗糙型RB51疫苗代替。S19疫苗目前仍是OIE認(rèn)可的布病參考疫苗，是印度、阿根廷、巴西等許多國(guó)家的布病參考疫苗[9]。自2001起，巴西為了降低國(guó)內(nèi)布魯氏菌病患病率和感染率，已開始實(shí)施對(duì)雌性犢牛實(shí)行強(qiáng)制免疫S19疫苗[10]。在蘇丹等非洲國(guó)家，S19疫苗株仍然是布病防控使用的主要疫苗[11]?？梢?，S19疫苗在世界防控布魯氏菌病工作中被廣泛使用，且一直發(fā)揮巨大作用。

在我國(guó)，A19(S19株在《中國(guó)獸藥典》中被稱為A19株)疫苗已經(jīng)使用了60多年，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里，對(duì)布魯氏菌防控起到至關(guān)重要作用。丁家波等[12]曾對(duì)我國(guó)保存的不同時(shí)期、不同國(guó)家來(lái)源S19菌株進(jìn)行過(guò)鑒定，均未檢測(cè)到ery基因的缺失。由此推測(cè)可能由于歷史的原因，我國(guó)當(dāng)時(shí)未引進(jìn)ery基因缺失的S19株，目前實(shí)際使用的A19株應(yīng)該是1956年前被廣泛使用的S19疫苗株。

2 疫苗的應(yīng)用

2.1 疫苗臨床效果 國(guó)外，美國(guó)國(guó)家動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室關(guān)于S19疫苗的總結(jié)報(bào)告指出，65%～75%免疫動(dòng)物不被感染，25%～35%免疫動(dòng)物雖然感染，但沒(méi)有流產(chǎn)等明顯臨床癥狀[13]。國(guó)內(nèi)，河北蘆臺(tái)應(yīng)用該苗，能有效防控因布魯氏菌引起的流產(chǎn)；對(duì)內(nèi)蒙古的黃牛群接種免疫A19后，布魯氏菌檢出率由免疫前的86.7%降低到免疫后的29.4%；在青海對(duì)母牦牛后免疫，流產(chǎn)率由免疫前的28.48%降低下降為1.26%；在新疆的5個(gè)奶牛養(yǎng)殖小區(qū)聯(lián)合使用S2和A19疫苗，經(jīng)過(guò)連續(xù)2年防控監(jiān)測(cè)，各個(gè)養(yǎng)殖小區(qū)能繁母牛流產(chǎn)率明顯下降，流產(chǎn)率最高的小區(qū)從超過(guò)10%下降至1%以下[14]。

S19(A19)疫苗的臨床效果明顯，能有效防控布魯氏菌感染，降低畜群死胎率和流產(chǎn)率，為畜群健康保健護(hù)航，同時(shí)還減少因能繁母牛死胎、流產(chǎn)所導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。

2.2 疫苗效果的影響因素 S19疫苗的免疫保護(hù)效力與免疫劑量、免疫途徑、動(dòng)物年齡、動(dòng)物群體免疫情況等因素有相關(guān)。

使用不同免疫劑量，S19疫苗能對(duì)動(dòng)物提供不同程度的流產(chǎn)保護(hù)力[15]。國(guó)外使用強(qiáng)毒2308株攻毒試驗(yàn)研究表明，疫苗有效注射量越高，其保護(hù)效果越好；使用低劑量多次免疫，也能得到較好的保護(hù)力。臨床應(yīng)用中，應(yīng)注意根據(jù)免疫動(dòng)物的實(shí)際情況，選用合適的免疫劑量。

免疫途徑也是影響疫苗效果的重要因素之一。以我國(guó)A19疫苗臨床使用為例，接種對(duì)象為育成牛和產(chǎn)后母牛，不能在懷孕牛上使用。懷孕母牛皮下注射免疫劑量S19疫苗，能夠引起約3.2%的流產(chǎn)率；當(dāng)給孕牛靜脈注射相同劑量時(shí)，流產(chǎn)率可達(dá)100%[16]。犢牛3～8月齡時(shí)進(jìn)行第一次皮下注射接種，18～20月齡(第1次配種前)進(jìn)行第二次免疫接種，疫苗產(chǎn)生的免疫有效保護(hù)期為72個(gè)月。一般不免疫3月齡以下犢牛，因?yàn)橐皇敲庖呦到y(tǒng)不健全，二是犢牛對(duì)布魯氏菌感染不敏感。該疫苗免疫公畜時(shí)，能導(dǎo)致睪丸炎的發(fā)生。正確的免疫途徑，能更好的發(fā)揮疫苗的效果，同時(shí)能避免不必要的意外和損失。

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，如果在牛只疫苗接種前已經(jīng)感染，即使接種疫苗，抗體持續(xù)陽(yáng)性，但機(jī)體一旦免疫機(jī)能降低，布魯氏菌仍能從細(xì)胞內(nèi)釋放進(jìn)入體液循環(huán)，引起機(jī)體啟動(dòng)記憶反應(yīng)，發(fā)揮細(xì)胞和體液免疫，將體液中的病原菌清除，這一過(guò)程伴隨著動(dòng)物的發(fā)熱等體征，隨后退熱，牛只看似恢復(fù)，但在細(xì)胞內(nèi)的病原菌并不能清除，導(dǎo)致機(jī)體反復(fù)發(fā)熱，對(duì)牛群構(gòu)成潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在免疫接種前必須保證牛只的健康，要對(duì)牛群進(jìn)行檢疫，血清學(xué)陽(yáng)性或出現(xiàn)發(fā)熱、流產(chǎn)等臨床指標(biāo)陽(yáng)性的可疑奶牛，必須隔離，只接種健康牛群，否則會(huì)造成牛群長(zhǎng)期隱性帶菌。

2.3 疫苗缺點(diǎn) 在長(zhǎng)期臨床使用過(guò)程，人們也發(fā)現(xiàn)S19疫苗有其局限性。如S19疫苗可以對(duì)免疫牛群產(chǎn)生較好的保護(hù)性，但對(duì)山羊免疫效果不太理想，對(duì)豬免疫則完全無(wú)效。S19疫苗是中等毒力疫苗，接種后可引起明顯局部反應(yīng)、能導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎等情況，大劑量接觸疫苗細(xì)菌時(shí)，甚至能引起人感染。所以在臨床使用時(shí)，一方面要注意疫苗的使用方法和免疫對(duì)象，另一方面，使用者必須做好自身防護(hù)，同時(shí)也要注意消毒，防止疫苗在環(huán)境擴(kuò)散。

另外，S19疫苗是光滑型布魯氏菌，其LPS含有O-側(cè)鏈，使用血清學(xué)方法檢測(cè)感染動(dòng)物時(shí)，不能區(qū)分動(dòng)物是自然感染還是疫苗接種，這給布魯氏菌病的流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)疫源地的掌控和疾病凈化工作帶來(lái)了阻礙。

3 疫苗研究

3.1 毒力評(píng)價(jià) 國(guó)際上通常有3種方法反映布魯氏菌的毒力：對(duì)豚鼠的最小感染量、感染豚鼠的脾臟含菌量以及感染小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間，其中對(duì)豚鼠的最小感染量通常用于對(duì)強(qiáng)毒株布魯氏菌毒力的測(cè)定。程君生等[17]使用小鼠體內(nèi)存活時(shí)間和豚鼠脾含菌量?jī)煞N方法，對(duì)我國(guó)現(xiàn)有的3種布病疫苗(A19、M5、S2)的毒力進(jìn)行了測(cè)定和分析，證明A19毒力介于S2和M5之間，且毒力穩(wěn)定不返強(qiáng)。同時(shí)，A19疫苗感染的豚鼠每克脾臟含菌量最高不超過(guò)20萬(wàn)，符合我國(guó)《獸用生物制品規(guī)程》中對(duì)布病疫苗種毒的毒力規(guī)定，認(rèn)為是可安全使用的臨床弱毒活疫苗。持續(xù)的定殖力可長(zhǎng)時(shí)間飼養(yǎng)的畜群，如奶牛、種畜等提供持久的保護(hù)力。

在分子水平上，鑒于我國(guó)A19株較目前國(guó)際流行使用的S19株仍ery基因序列，與前期S19疫苗株一致，故認(rèn)為毒力高于國(guó)際S19疫苗株。但研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌強(qiáng)毒株也存在ery基因序列缺失的情況，卻并不會(huì)像S19一樣毒力致弱，所以研究人員認(rèn)為赤蘚醇代謝受影響并不是導(dǎo)致S19毒力致弱的主要原因。對(duì)牛種布魯氏菌強(qiáng)毒株和S19疫苗株進(jìn)行了全基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)分析，鑒定了新的可能導(dǎo)致S19疫苗株毒力致弱的基因，對(duì)這些基因的進(jìn)一步功能驗(yàn)證有助于闡明S19的毒力機(jī)制[18]。

3.2 對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答機(jī)理 在體液免疫方面，用S19接種牛后，LPS通過(guò)激活B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)抗體分泌，能產(chǎn)生高滴度的IgG1、IgG2和IgM，以及低濃度的IgA[19]，接種小鼠則能產(chǎn)生大量O鏈特異性的IgG1、IgG2b和IgM[20]。IgG2抗體Fc區(qū)能結(jié)合吞噬細(xì)胞上的Fc受體，促進(jìn)細(xì)胞的吞噬作用和殺菌作用。[21]。

細(xì)胞免疫方面，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，接種S19后，能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生IL-2、TNF-α、IFN-γ，另外還誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗原特異性的CD4+和粒酶分泌CD8+T細(xì)胞，但不產(chǎn)生IL-4和IL-10[22]。有研究表明，牛接種S19后，特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫組分被刺激，表現(xiàn)為IFN-γ產(chǎn)生和CD4+或CD8+ T細(xì)胞增加[23]。接種S19后，牛和鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞，在體外用布魯氏菌特異性蛋白質(zhì)刺激時(shí)，與未接種疫苗的動(dòng)物相比，增殖速率明顯提高[24]。

S19疫苗是光滑型布魯氏菌，其結(jié)構(gòu)中存在LPS，能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫。另一方面布魯氏菌是胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體細(xì)胞免疫對(duì)抑制布魯氏菌發(fā)揮至關(guān)重要的作用。S19疫苗激活機(jī)體細(xì)胞免疫并誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，能有效提高機(jī)體對(duì)野毒抵抗力。

3.3 疫苗改良 在血清學(xué)方法上，S19疫苗株是光滑型布魯氏菌，其LPS含有O側(cè)鏈，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體類型與野毒株誘導(dǎo)的抗體相像，這使得常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物。分子生物學(xué)方法上，目前國(guó)際上廣泛使用的S19存在ery基因缺失，OIE將這一特點(diǎn)作為S19與野毒株鑒別診斷依據(jù)[25]。但我國(guó)使用的A19疫苗株較國(guó)外使用的S19株而言，不存在缺失情況，所以該方法不適用于A19株。尋求可鑒別診斷方法、保持良好免疫原性是S19疫苗兩個(gè)重要的研究方向。

在疫苗鑒別方面，有研究發(fā)現(xiàn)VirB8基因上108位堿基的G-T突變，可作為A19疫苗株與野生菌株的鑒別依據(jù)之一[26]；利用A19赤蘚醇代謝基因序列差異，可區(qū)分我國(guó)疫苗株A19和牛I型強(qiáng)毒株2308[27]，但是上述兩種方法還未能明確區(qū)分出A19疫苗株與野毒株。利用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析方法，可鑒別A19與野生菌株，但操作復(fù)雜[28]。通過(guò)檢測(cè)比對(duì)SNP位點(diǎn)可較快速、簡(jiǎn)便區(qū)分S19和其它野毒株[29]；Gopaul等[30]建立的S19鑒別檢測(cè)熒光定量PCR方法，目前同樣適用于我國(guó)布魯氏菌A19疫苗株的鑒別診斷。

除對(duì)傳統(tǒng)S19疫苗差異性研究，新型疫苗的研究一直在進(jìn)行。對(duì)于S19(A19)疫苗的改進(jìn)，在保持其良好免疫源性和遺傳穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，可通過(guò)加入標(biāo)記基因等方式，提高鑒別診斷有效性和簡(jiǎn)便性。目前，多個(gè)候選物可用作標(biāo)記基因，如：bp26基因，P39基因和綠色/紅色熒光蛋白(GFP/RFP)基因。Bp26蛋白是有效的免疫原，但有實(shí)驗(yàn)證明，在缺乏Bp26蛋白的表達(dá)的情況下，并不影響S19疫苗在小鼠或懷孕母牛中的保護(hù)能力[31]。在小鼠模型中，免疫顯示蛋白P39的表達(dá)缺失不影響S19疫苗的保護(hù)功效[32]，也可以作為標(biāo)記基因。具有標(biāo)記基因A19-ΔVirB12突變株[33]和缺失wboA基因的RB6株[34]，其保護(hù)力和穩(wěn)定性與A19株相當(dāng)，且可以有效區(qū)別野毒感染，是S19疫苗改進(jìn)較成功的例子。

4 結(jié) 語(yǔ)

布魯氏菌病是一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病，在布病的綜合防控措施中，至今為止，使用弱毒疫苗仍是控制動(dòng)物布病的最有效的方法。S19是光滑型弱毒活疫苗，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠且持久的保護(hù)力，毒力穩(wěn)定不返強(qiáng)，有效保護(hù)畜群，抵御野毒感染，降低流產(chǎn)率。S19疫苗作為世界范圍內(nèi)第一個(gè)廣泛使用的布魯氏菌活疫苗，且一直沿用至今，對(duì)全球布病防控具有相當(dāng)重要的地位和意義，同時(shí)也足見該疫苗的效果長(zhǎng)期得到認(rèn)可。在臨床上，S19疫苗有其優(yōu)越性，但布魯氏菌分型眾多，單一疫苗的使用不足以完全滿足布病防控的需求，所以除S19外，還有像S2、RB51、Rev.1等其他效果良好的疫苗在使用。近些年來(lái)，世界范圍布病疫情有持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，特別是我國(guó)布病疫情呈較明顯的反彈，對(duì)畜牧生產(chǎn)和公共衛(wèi)生健康存在重大威脅，加強(qiáng)布病防控和凈化勢(shì)在必行，優(yōu)秀的疫苗的研發(fā)和使用更顯得迫在眉睫。隨著布魯氏菌致病性及免疫原性相關(guān)的生物分子機(jī)制深入研究和當(dāng)下對(duì)疫情控制與凈化的要求，新疫苗應(yīng)兼具安全性、穩(wěn)定性、高保護(hù)性、標(biāo)記性于一身。

使用良好的疫苗在布病防控中是有效的措施，但要完全控制布病疫情及凈化布病，還必須配合多種外部工作，如提高對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)群體(特別是養(yǎng)殖戶)對(duì)疾病的認(rèn)知、加強(qiáng)預(yù)防措施和監(jiān)測(cè)水平、建立完善疫情通報(bào)及處理系統(tǒng)等。目前布病疫情廣泛且復(fù)雜，但隨著社會(huì)的重視、研究的深入，相信不久將來(lái)，以疫苗為基礎(chǔ)的綜合防治措施能從根本上降低布病的發(fā)生和傳播，最終達(dá)到布病凈化的目標(biāo)。

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(編輯：李文平)

Research Progress and Application ofBrucellaabortusStrain 19

YE Jun-xian1,2，F(xiàn)ENG Yu1，CHEN Rui-ai2*，DING Jia-bo1*

(1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

CHEN Rui-ai, E-mail: chensa727@yahoo.com; DING jia-bo, E-mail: dingjiabo@ 126.com

Brucellosis is a crucial zoonosis caused by brucella，and it causes great losses to farming and theat to health of human being. Vaccination is one of the most effective measures used to control this disease. The first wiedly effective brucella vaccine wasBrucellaabortusstrain 19(S19). Nowadays,Brucellaabortusstrain 19 is still one of the most widely used brucella vaccine in the world and plays an important role in prevention of brucellosis. Both application and research progress which about theBrucellaabortusstrain 19 vaccine were reviewed in this paper in order to provide reference of using this vaccine to control brucellosis in the future and provide ideas for vaccine research.

Brucellaabortus；brucellosis；S19 vaccine

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.13

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500902)

葉俊賢，碩士研究生，從事重要人畜共患病診斷技術(shù)研究。

陳瑞愛(ài)，E-mail: chensa727@yahoo.com；丁家波，E-mail: dingjiabo@ 126.com

2016-11-28

A

1002-1280 (2017) 05-0062-06

S852.61