楊 玲 方新元 賈立云 蔡擴(kuò)軍 徐 敏 蒲敬偉

（1.烏魯木齊市高新區(qū)（新市區(qū)）六十戶鄉(xiāng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆烏魯木齊 830082；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 831400；3.烏魯木齊市天山區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 830001；4.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；5.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆烏魯木齊 830009）

沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)

楊 玲1方新元2賈立云3蔡擴(kuò)軍4*徐 敏4蒲敬偉5

（1.烏魯木齊市高新區(qū)（新市區(qū)）六十戶鄉(xiāng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆烏魯木齊 830082；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 831400；3.烏魯木齊市天山區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 830001；4.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；5.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆烏魯木齊 830009）

本研究對(duì)80份沙門氏菌樣品進(jìn)行前增菌，然后用熒光PCR方法對(duì)前增菌樣品進(jìn)行檢測，挑取陽性樣品進(jìn)行后續(xù)的分離、鑒定。結(jié)果顯示，本研究在傳統(tǒng)沙門氏菌分離、鑒定方法基礎(chǔ)上增加了熒光PCR初步篩選，提高了檢測的靈敏度與特異性，省工省時(shí)，最終分離到12株沙門氏菌。

沙門氏菌 熒光PCR 分離 鑒定

沙門氏菌是最常見的食源性人畜共患病原菌之一[1]。在自然界分布廣泛，血清型種類繁多，該菌的最適生長溫度為37℃左右，在20℃以上即可大量繁殖，在冰箱中可存活3～4個(gè)月[2]。消費(fèi)者食用被沙門氏菌污染的食物12～72 h后即可出現(xiàn)腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等發(fā)病癥狀[3]。近年來，沙門氏菌在全球范圍內(nèi)引起的食源性疾病數(shù)量不斷上升，即便在歐美發(fā)達(dá)國家仍然難以控制。在歐洲，每年有超過16萬人感染沙門氏菌，美國每年約發(fā)生感染沙門氏菌病例140萬例。同時(shí)，沙門氏菌也是引起我國細(xì)菌性食物中毒的首要原因[4-6]。因此，開展對(duì)肉樣和環(huán)境中沙門氏菌的檢驗(yàn)具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義。

在有較多樣品量的情況下，完全采用國標(biāo)傳統(tǒng)檢測程序方法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行分離、鑒定，耗時(shí)長、靈敏度低、試劑藥品消耗多、工作量大，而熒光PCR方法雖然具有特異性好、靈敏度高、操作簡單、安全、自動(dòng)化程度高等很多優(yōu)點(diǎn)，但只能檢測到是否存在病原菌，最終分離不到沙門氏菌菌株[7-8]。鑒于此，本研究將二者結(jié)合起來，對(duì)沙門氏菌檢測技術(shù)方法進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，以期為沙門氏菌的檢驗(yàn)及該病的防控提供有益參考。

1 材料

1.1 樣品

畜禽糞便、畜禽肉、酮體拭子、環(huán)境拭子各20份，一共80份樣品。

1.2 主要試劑

顯色培養(yǎng)基購自法國科瑪嘉公司；細(xì)菌分離鑒定的其他試劑購自北京陸橋公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒購自澳東檢驗(yàn)檢測科技有限公司；細(xì)菌鑒定卡購自美國bioMerieux Inc 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.4 主要儀器

法國梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK-2-CompactII；恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 檢驗(yàn)程序

2.2 操作步驟

2.2.1 前增菌

稱取25 g（ml）樣品放入盛有225ml BPW 的無菌均質(zhì)杯中，以8000～10000 r/min 均質(zhì)1～2 min，或置于盛有225ml BPW 的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH 值，用1 mol/ml無菌NaOH或HCl 調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500 ml錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)8～18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15 min，或2℃～5 ℃不超過18 h 解凍[9]。

若為環(huán)境拭子樣品。將盛有6mL BPW的離心管直接帶到采樣地點(diǎn)，采集環(huán)境拭子后快速打開蓋子，將拭子放進(jìn)后，迅速蓋上蓋子，帶回實(shí)驗(yàn)室，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)8～18 h。

若為糞便樣品。將盛有6 mLBPW離心管直接帶到采樣地點(diǎn)，采集糞便拭子后快速打開蓋子，將拭子放進(jìn)后，迅速蓋上蓋子，帶回實(shí)驗(yàn)室，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)8～18 h。

2.2.2 PCR初篩

用細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒，參照說明書提取細(xì)菌核酸。用沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，參照說明書進(jìn)行熒光PCR檢測。

2.2.3 增菌

取PCR陽性的前增菌液1mL接種于10mlTTB，于42 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.2.4 分離

接種環(huán)取TTB 1環(huán)，劃線接種于一個(gè)XLD平板，一個(gè)顯色培養(yǎng)基，觀察各個(gè)平板上生長的菌落。

2.2.5 革蘭氏染色鏡檢

對(duì)分離鑒定培養(yǎng)基上的可疑菌落進(jìn)行純化，革蘭氏染色，鏡檢。

2.2.6 全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行生化鑒定

根據(jù)革蘭氏染色情況，選擇對(duì)應(yīng)細(xì)菌鑒定卡，用法國梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK-2-CompactII進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)熒光PCR檢測，一共出現(xiàn)了12份陽性，圖1。

3.2 分離平板上菌落顏色及形態(tài)

典型的沙門氏菌在XLD 瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心（圖2）。典型的沙門氏菌在顯色培養(yǎng)基呈現(xiàn)紫紅色。

3.3 革蘭氏染色鏡檢

沙門氏菌呈革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（0.7～1.5μm）×（2～5μm）（比大腸桿菌細(xì)），散在，無莢膜和芽孢，圖3。

3.4 全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行生化鑒定

經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行生化鑒定，一共分離出12株沙門氏菌。

4 討論

傳統(tǒng)食源性人畜共患細(xì)菌檢測檢驗(yàn)程序復(fù)雜煩瑣，尤其在樣品量較大的情況下，耗時(shí)費(fèi)力，而熒光PCR法具有快速簡便、敏感特異等優(yōu)點(diǎn)，在臨床疾病診斷、動(dòng)物疾病檢測、食品安全等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[10]。本研究用熒光PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行初步篩選，選取陽性樣品再進(jìn)行下一步分離鑒定，提高了沙門氏菌的檢出率和工作效率，為食源性細(xì)菌的快速檢測提供了科學(xué)依據(jù)。但值得注意的是，由于熒光定量PCR只檢測病原的核酸，并不能區(qū)分病原菌是否具有生物學(xué)活性。因此，如果樣品中沙門氏菌物無生物學(xué)活性，PCR檢測為仍陽性率，但并不能分離到沙門氏菌菌株。

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[10] 任秀.食品中沙門氏菌快速檢測方法的研究[D].吉林大學(xué)，2011.

新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程（qn2015jc058）；烏魯木齊市科技局現(xiàn)代服務(wù)業(yè)促進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目（Y141310002）；兵團(tuán)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目（2015AC026）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題

楊玲（1974-），女，本科，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防治工作。

蔡擴(kuò)軍（1985-），男，碩士，獸醫(yī)師，主要從事食源性人畜共患病原菌及動(dòng)物疫病防控工作。