張洪軍 李秀慧 路廣計 陳瑞蘭 王會敏王佩綺 尹利利 劉國臣 張秀麗 趙曉光 曹 瑞

（1.河北省圍場縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北圍場 068450；2.河北省圍場縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050000；3.青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，山東青島 266100）

牛結(jié)核高污染場的監(jiān)測與凈化

張洪軍1李秀慧1路廣計2陳瑞蘭1王會敏1王佩綺1尹利利1劉國臣1張秀麗1趙曉光1曹 瑞3

（1.河北省圍場縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北圍場 068450；2.河北省圍場縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050000；3.青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，山東青島 266100）

比較不同的試驗方法，尋找適合高污染場奶牛結(jié)核病的檢測及凈化方法。方法：同時采用單純牛結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（TST）、比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（SICTT）、牛結(jié)核病ELISA γ-干擾素檢測試驗（IFN-γ-ELISA）、牛結(jié)核病抗體ELISA檢測方法和牛結(jié)核病抗體免疫膠體金方法對某結(jié)核病污染奶牛場30頭不同年齡牛進(jìn)行結(jié)核病檢測，評價不同方法的優(yōu)缺點，探討最佳的檢測方案及凈化方法。經(jīng)綜合判定牛型結(jié)核陽性20頭（其中5頭為牛型、禽型雙陽性）、陰性10頭（其中1頭為禽型陽性），牛型結(jié)核陽性率66.67%、禽型結(jié)核陽性率63.33%、二者混合感染率為63.33%。試驗表明，僅靠一種活體檢測方法難以做出牛結(jié)核病準(zhǔn)確診斷。因此，可采用TST初篩，陽性和可疑牛用IFN-γ-ELISA復(fù)檢以排除部分假陽性，對于早期感染牛場可直接采用IFN-γ-ELISA方法檢測并按照相應(yīng)的方案進(jìn)行凈化。

牛結(jié)核病 檢測 凈化

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的人獸共患傳染病，國際動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的B類動物疫病，在世界各地均有發(fā)生，我國列為二類動物疫病，也是常見的多發(fā)病[1]。由于牛結(jié)核病是一種慢性進(jìn)行性傳染病，在感染早中期肉眼很難發(fā)現(xiàn)可見癥狀，即使感染晚期表現(xiàn)出癥狀也不特異，難以通過臨床觀察做出準(zhǔn)確診斷。只能通過剖檢和細(xì)菌培養(yǎng)才能確診，但此法不能用于活畜[2]。目前活畜檢測最理想、有效且廣泛應(yīng)用的方法主要有牛結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（TST）、比較皮內(nèi)變態(tài)試驗（SICTT）和牛γ-干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗（IFN-γ-ELISA）。

TST是我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的唯一方法，應(yīng)用最為廣泛。OIE將SICTT列為TST的替代試驗或平行試驗，澳大利亞、新西蘭和歐美等許多國家批準(zhǔn)為正式試驗[3，4]。

本試驗采用上述方法對規(guī)?；膛鲞M(jìn)行結(jié)核病檢測，對實驗結(jié)果進(jìn)行綜合分析，為實際生產(chǎn)提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，減少因誤診造成的撲殺損失，同時為凈化規(guī)?；膛鋈禾峁┘夹g(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

牛型PPD（批號201502）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，100頭/瓶，禽型PPD（批號200603）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，100頭/瓶，牛結(jié)核病ELISA γ-干擾素檢測試劑盒（批號：R201603-001），青島瑞爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；牛分枝桿菌ELISA抗體檢測試劑盒（批號：160804），購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司；牛結(jié)核病抗體膠體金檢測試劑盒（批號：2302DG006），購自廣州悅洋生物技術(shù)有限公司，副結(jié)核ELISA抗體檢測試劑盒（批號：6332501301），購自prionics公司。

1.1.2 試驗動物

某奶牛場的30頭奶牛，其中，泌乳牛、育成牛和犢牛各10頭。

1.1.3 器材

剪毛剪、0.5 mL注射器、游標(biāo)卡尺、酶標(biāo)儀（包含450nm和620-650nm濾光片）、CO2培養(yǎng)箱、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、肝素采血管、移液器及吸頭等。

1.2 方法

1.2.1 單純皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（TST）

參照《動物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T18645-2002）進(jìn)行試驗

1.2.2 比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（SICTT）

采用牛PPD和禽PPD，統(tǒng)一在牛頸部左側(cè)分點皮內(nèi)注射，兩個注射點間隔12～15cm。牛型PPD皮厚差減去禽型PPD皮厚差的數(shù)值大于4 mm判為陽性；大于1 mm小于4 mm判為可疑；牛型PPD皮厚差小于等于禽型PPD皮厚差判為陰性。

1.2.3 IFN-γ-ELISA試驗

無菌采集肝素抗凝全血，8 h內(nèi)在實驗室分成3份置于培養(yǎng)板孔內(nèi)，分別用牛PPD、禽PPD和PBS刺激，置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)16～24h。收集上清，按牛結(jié)核病ELISA γ-干擾素檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。每孔加100μL待測樣品和對照品于相應(yīng)孔中，室溫孵育1h。洗滌4次，每孔加100μL酶標(biāo)抗體，室溫孵育1h。洗滌4次，每孔加100μLTMB溶液，室溫避光孵育10min。每孔加入50μL終止液，讀取OD630值。按下列公式判定：當(dāng)牛PPD刺激上清OD值—禽PPD刺激上清OD值≥0.1，且牛PPD刺激上清OD值—PBS刺激上清OD值≥0.1時，判為牛結(jié)核陽性；當(dāng)牛PPD刺激上清OD值—禽PPD刺激上清OD值＜0.1或牛PPD刺激上清OD值—PBS刺激上清OD值＜0.1時，判為牛結(jié)核陰性。

1.2.4 牛結(jié)核抗體ELISA試驗

按照牛分枝桿菌ELISA抗體檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行并進(jìn)行相應(yīng)結(jié)果的判定。

1.2.5 牛結(jié)核抗體膠體金檢測試驗

用吸管滴一滴樣品至檢測孔，10min觀察結(jié)果。檢測線和對照線均顯色判為陽性，對照線顯色而檢測線不顯色為陰性，對照線不顯色試驗不成立。

1.2.6 試驗結(jié)果對比分析

對比分析TST試驗、SICTT試驗、IFN-γ-ELISA試驗、牛結(jié)核抗體ELISA試驗和牛結(jié)核抗體膠體金試驗。

2 結(jié)果

30頭牛經(jīng)TST、SICTT、IFN-γ-ELISA、抗體ELISA和抗體膠體金方法檢測，其中TST試驗20頭陽性4頭可疑，SICTT試驗19頭陽性4頭可疑，IFN-γ-ELISA試驗25頭陽性，抗體ELISA試驗均為陰性，抗體膠體金試驗1頭弱陽性。結(jié)果詳見表2。

表2 不同檢測方法檢測結(jié)果

表3 不同試驗方法檢測結(jié)果

實驗判定結(jié)果表明，試驗牛群既有牛分枝桿菌感染，又有禽結(jié)核分枝桿菌感染，前者感染率為66.67%（20/30），后者感染率為63.33%（19/30），二者混合感染率為63.33%（19/30）。INF-γ感染率為83.33%（25/30），除膠體金抗體檢測20#為陽性，其他均為陰性，見表3。由此判斷此奶牛場是牛結(jié)核高污染的場。

3 討論

目前我國及全球范圍內(nèi)運用最廣泛的檢測方法是TST，但是其檢測結(jié)果受其他病原感染、藥物、試劑質(zhì)量及劑量、人為誤差、個體差異等很多因素干擾[2]，會造成一定比例的假陽性、假陰性，從而降低其敏感性、特異性、準(zhǔn)確性。本試驗通過TST檢測確認(rèn)本場群63.33%感染了牛、禽結(jié)核分枝桿菌。TST檢測方法成本較低，耗時相對較長，準(zhǔn)確率較低，而且早期感染牛難以檢出，60d內(nèi)復(fù)檢陽性率降低。特異性均低于SICCT、IFN-γ-ELISA。同時由于人為誤差造成假陰性，致使其敏感性降低。

盡管抗體膠體金檢測是最近出現(xiàn)的快速、簡便的檢測方法，但是通過本實驗的結(jié)果可以看出通過抗體檢測的方法檢測的結(jié)果存在誤差，產(chǎn)生25個假陰性，原因之一是患病個體免疫功能低下，抗體水平低，無法檢測出來。再者可能是不同機體的免疫水平存在差異，患病個體處于臨床感染初期，結(jié)核抗體的產(chǎn)生處于“窗口期”。而假陽性產(chǎn)生的原因可能是自然結(jié)核分枝桿菌感染后體內(nèi)存在一定水平的抗體，因此抗體檢測雖簡潔快速但不適用。

4 建議

針對此類污染場，我們建議先按1.2.1的方法對規(guī)模化奶牛場存欄奶牛按100%進(jìn)行檢測初篩，初篩結(jié)束后將該奶牛場分為污染群、穩(wěn)定控制群、凈化群。

對于污染群按1.2.1及1.2.3的試驗方法進(jìn)行普檢。確定的陽性個體進(jìn)行撲殺銷毀，按照 G/B16548執(zhí)行，而陰性個體進(jìn)入穩(wěn)定控制群繼續(xù)監(jiān)測。

對于穩(wěn)定控制群按1.2.1及1.2.3試驗方法每隔2個月進(jìn)行普檢。確定的陽性個體進(jìn)行撲殺銷毀，按照GB16548 執(zhí)行，陰性個體每兩個月進(jìn)行一次普檢，連續(xù)監(jiān)測2年，若無陽性出現(xiàn)，進(jìn)入凈化群。

成為凈化群的規(guī)模奶牛場，以后每半年監(jiān)測一次，場群100%監(jiān)測。

[1] 何昭陽.牛結(jié)核病研究進(jìn)展[J].預(yù)防獸醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001，3（4）：34-39.

[2] 路廣記，曹瑞，張軍，等.對奶牛結(jié)核病平行檢測的不同方法[J].中國動物檢疫，2014，31（12）：43-46.

[3] Rollins D M，Colwell R R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment[J].Appl Environ Microbiol，1986，（52）：531-538.

[4] Josefsen M H，Lofstrom C，Hansen T B，et al.Rapid quantification of viable Campylobacter bacteria on chicken carcasses，using real-time PCR and propidium monoazide treatment，as a tool for quantitative risk assessment[J].Appl Environ Microbiol，2010，（76）：5097-5104.