陳麗竹，盧金淼，郁穎佳，段更利，李智平（復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海201102）

小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物水解方法及促進酶解反應(yīng)方法的研究進展Δ

陳麗竹＊，盧金淼，郁穎佳，段更利，李智平#（復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海201102）

目的：為小分子藥物Ⅱ相代謝過程研究及相關(guān)分析提供參考。方法：查閱近幾年相關(guān)研究文獻，歸納小分子藥物Ⅱ相代謝常見結(jié)合反應(yīng)的類型并總結(jié)其代謝綴合物水解方法及促進酶解反應(yīng)方法的研究進展。結(jié)果與結(jié)論：Ⅱ相代謝是Ⅰ相代謝物在體內(nèi)的結(jié)合反應(yīng)，包括糖苷結(jié)合、硫酸化、甲基化、乙?；?、氨基酸結(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、縮合反應(yīng)等。其中，最常見的小分子藥物Ⅱ相代謝反應(yīng)是與葡萄糖醛酸結(jié)合或與硫酸結(jié)合，生成葡萄糖醛酸苷綴合物或硫酸酯綴合物。小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物常見的水解方法包括酸水解、堿水解和酶水解。其中，酶水解以其安全、溫和、不會引起目標(biāo)物分解、重復(fù)性好、藥物回收率高等優(yōu)點，成為目前使用最廣泛的水解方法。促進酶解反應(yīng)的方法目前主要有紅外輻射法和超聲波法，兩種方法都對不同的酶系反應(yīng)有促進作用。

小分子藥物；Ⅱ相代謝綴合物；水解方法；酶解反應(yīng)；紅外輻射法；超聲波法

藥物在體內(nèi)需要經(jīng)歷吸收、分布、代謝、排泄的過程。藥物的代謝又稱為藥物的生物轉(zhuǎn)化，是指藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布之后，在酶的作用下經(jīng)歷化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的過程。目前，該領(lǐng)域研究范圍較廣，包括：代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和活性研究、新代謝方法的研究、藥物代謝酶的研究、代謝選擇性的研究、藥物代謝的影響因素研究，等等。一般來說，藥物進入體內(nèi)后都要發(fā)生各種酶的催化下的化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)可以最大程度地減少外源性物質(zhì)對機體的不良影響，是生物體長期進化的結(jié)果。對藥物的代謝及代謝物的研究有助于了解藥物在體內(nèi)的變化情況，闡明藥物的有效性、毒性及作用機制。

藥物代謝分為Ⅰ相反應(yīng)和Ⅱ相反應(yīng)[1-4]。Ⅰ相反應(yīng)包括氧化、還原和水解等反應(yīng)。Ⅱ相反應(yīng)也稱為結(jié)合反應(yīng)，包括糖苷結(jié)合、硫酸化、甲基化、乙?；被峤Y(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、縮合反應(yīng)等。小分子藥物經(jīng)過Ⅰ相反應(yīng)后，分子結(jié)構(gòu)中增加了羥基、羧基等極性基團，使其水溶性增加，易于從泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中排泄。同時，這些Ⅰ相代謝物還能夠與體內(nèi)的一些內(nèi)源性化合物結(jié)合發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)，生成極性更大的新的代謝物從尿液中排出體外。這些內(nèi)源性化合物主要有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸和乙酰輔酶A等。其中，與葡萄糖醛酸或硫酸的結(jié)合反應(yīng)最為常見，生成葡萄糖醛酸苷綴合物或硫酸酯綴合物。藥理學(xué)、藥動學(xué)、代謝組學(xué)等研究工作都需要對藥物Ⅱ相代謝綴合物進行分析。但是，藥物Ⅱ相代謝綴合物因為成分復(fù)雜且極性大不易被有機溶劑提取，故需要先對這些綴合物進行水解，以便藥物釋放出來，從而進行后續(xù)處理與分析。筆者查閱近幾年相關(guān)研究文獻，總結(jié)了小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物水解方法及促進酶解反應(yīng)方法的研究進展，旨在為小分子藥物Ⅱ相代謝過程研究及相關(guān)分析提供參考。

1 小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物水解方法

常見的水解方法有酸水解、堿水解和酶水解。

酸水解通常使用高氯酸、鹽酸或三氯乙酸等進行水解。李偉紅、顏流水、吳永寧等[5-7]就分別用以上3種不同的酸進行了Ⅱ相代謝綴合物的水解。

堿水解常用氫氧化鈉（NaOH）溶液或堿性緩沖液進行水解。張雪曼等[8]在測定動物尿液中克倫特羅和沙丁胺醇時，就先用0.5 mol/L NaOH溶液進行了前處理。

酶水解常使用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶在pH 4.6～5.2的乙酸銨緩沖溶液中進行水解，水解時間為2～24 h不等，溫度控制在37℃左右。王鳳美、曾少東、李陽、王國民等[9-12]就分別利用酶水解法處理了動物食品、尿液、肉制品、血液中的β受體激動藥Ⅱ相代謝綴合物殘留。其中，李陽等[11]還比較了采用酶水解與不采用酶水解的情況下藥物的提取率，發(fā)現(xiàn)采用酶水解后藥物的提取率顯著增加。

通過文獻調(diào)研和總結(jié)發(fā)現(xiàn)，酸水解和堿水解的優(yōu)點是：簡便、快速、成本低廉，并能減少酶水解過程中酶制劑和其樣品水解后產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)對目標(biāo)化合物的干擾；缺點是：水解反應(yīng)較劇烈，可能會造成某些目標(biāo)物的分解。酶水解的優(yōu)點是：安全、條件比較溫和，不會引起目標(biāo)物分解，且重復(fù)性好，藥物回收率高；缺點是：使用成本較高，反應(yīng)時間較長，且酶水解過程中酶制劑和其樣品水解后產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)對目標(biāo)化合物可能產(chǎn)生干擾。從目前的文獻報道中可知，因酶水解具備酸水解和堿水解所不具備的諸多優(yōu)點，故實際工作中最為常用。

2 促進酶解反應(yīng)方法

酶水解因具有多種優(yōu)點而在小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物研究中得到廣泛的使用，但是酶解反應(yīng)時間較長，一般為2～24 h，而這增加了整個研究工作的時間，并有可能會導(dǎo)致部分生物樣品變質(zhì)，給相關(guān)研究帶來不便。因此，加快酶解反應(yīng)的速率對于縮短整個酶水解過程耗費的時間是有必要的。酶解反應(yīng)相對其他水解反應(yīng)來說具有較嚴格的溫度控制要求，所以升溫等常規(guī)加速反應(yīng)的方法不適用，必須考慮在反應(yīng)過程中增加其他能量源。目前用于促進酶解反應(yīng)的方法主要有紅外輻射法和超聲波法。

2.1 紅外輻射法

紅外輻射是介于可見光與微波之間的電磁波，其波長范圍在約0.76～1 000 μm之間。傳統(tǒng)上把紅外光分為3個區(qū)域：波長為0.76～1.44 μm的紅外光稱作近紅外光；波長為1.44～3.00 μm的紅外光稱作中紅外光；波長為3.00～1 000 μm的紅外光稱作遠紅外光[13-14]。紅外輻射相比較其他的能量源來說具有其獨特的優(yōu)點：（1）安全環(huán)保。與微波相比，紅外輻射對人體的危害極小，無需考慮泄露的問題。波長為8～14 μm的紅外光更是生物生存必不可少的因素，被稱為“生命光波”。（2）節(jié)能高效。紅外輻射熱量是以電磁波形式傳遞的，不需要任何媒介，同時也不會產(chǎn)生任何廢棄物污染周圍環(huán)境。同時，生物物料對紅外光的吸收率較高。（3）節(jié)省成本。與微波等其他裝置相比，紅外輻射裝置價格低廉，易于推廣。

紅外輻射促進酶解反應(yīng)的機制在于大多數(shù)活性化合物和提取溶劑（水、有機溶劑）的吸收光譜均在2.5～25 μm之間，處于紅外輻射的范圍內(nèi)，因此紅外輻射可到達物料內(nèi)部，使基質(zhì)內(nèi)部溫度上升，增加各個有效成分在介質(zhì)中的溶解度，同時加速反應(yīng)終產(chǎn)物向溶劑的擴散，從而縮短反應(yīng)時間，提高效率[15-18]。

Silveira PC等[19-20]對大鼠經(jīng)過潰瘍和創(chuàng)傷后的細胞色素氧化酶的活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)在紅外光（0.904 μm）作用下，細胞色素氧化酶活性增加。Hu WP等[21]研究發(fā)現(xiàn)近紅外光的照射能夠使細胞色素氧化酶的氧化速率提高1倍。Yu W等[22]也報道在紅外光的照射下細胞色素氧化酶的氧化速率提高了80%。有研究者利用紅外光頻率與蛋白質(zhì)分子、胰蛋白酶分子運動頻率相一致的原理，可引起蛋白質(zhì)分子骨架結(jié)構(gòu)的共振效應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子處于高能狀態(tài)，同時增加胰蛋白酶分子的活性，從而加速了蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)，將蛋白質(zhì)酶解時間從傳統(tǒng)水浴酶解時間10 h左右縮短到幾分鐘[23-24]。另有研究者研制了一個溫度可控的紅外輻射系統(tǒng)，以期在一個相對恒定的溫度下運用紅外輻射加速酶解反應(yīng)，并通過模型樣品蛇床子的酶解反應(yīng)過程對該系統(tǒng)的可行性和性能進行了論證。在該試驗中，采用紅外輔助提取所得蛇床子素和歐前胡素的提取率統(tǒng)計學(xué)上均顯著高于采用超聲輔助提取所得的提取率（P＜0.05），酶解反應(yīng)時間由傳統(tǒng)水浴酶解的1 h大幅縮短到了2 min[25]。

2.2 超聲波法

超聲波是指頻率大于19.2 kHz的聲波，具有波動與能量雙重屬性，是一種均勻的球面機械波，可在液體內(nèi)部產(chǎn)生強烈的沖擊波和微射流，使出現(xiàn)局部高溫、高壓，導(dǎo)致諸多次級效應(yīng)，如擊碎、乳化、擴散、強烈的機械振蕩等，從而可加速體系的傳質(zhì)、傳熱等過程。當(dāng)超聲波振動時會產(chǎn)生并傳遞強大的能量，使起媒質(zhì)質(zhì)點以極高的速度和加速度進入振動狀態(tài)，媒質(zhì)結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化，促使有效成分進入溶劑中。當(dāng)振動處于稀疏狀態(tài)時，液體會被撕裂成很多的小空穴，這些小空穴瞬間閉合會產(chǎn)生高達幾千大氣壓的瞬時壓力，即空化現(xiàn)象。這種空化現(xiàn)象有利于提高目標(biāo)物提取率[26-27]。

一定條件下，超聲波可以促進不同酶解反應(yīng)體系中的酶解速率加快，從而縮短酶解反應(yīng)時間。Adewale P等[28]研究了超聲波的不同功率對酶促?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的影響，得到了促進該反應(yīng)的最佳超聲振幅；Badgujar KC等[29]研究表明超聲波能夠提高生物催化中脂肪酶的活性，從而促進酶解反應(yīng)；BasharI M等[30]研究表明超聲波可以促進葡聚糖酶對葡萄糖聚合物的降解作用；Subhedar PB等[31]研究證實了低強度的超聲波提高了細胞中纖維素酶的活性，從而促進了酶解速率加快。

以上研究表明，超聲時間、溫度、功率、頻率等條件均對超聲波對于酶解反應(yīng)的促進作用有影響。但超聲參數(shù)選擇不合適，反而可能會抑制酶解反應(yīng)的進行。因此，要達到促進酶解反應(yīng)的目的，必須根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)某晽l件。

3 結(jié)語

研究藥物的代謝，對新藥研發(fā)、制劑工藝優(yōu)化和臨床安全用藥都具有重要指導(dǎo)意義。藥物在體內(nèi)的代謝反應(yīng)尤其是Ⅱ相代謝復(fù)雜且多變，從而導(dǎo)致了藥物在體內(nèi)存在的形式不同，又由于體內(nèi)介質(zhì)組成繁雜、待測藥物濃度偏低等原因，樣品的前處理一直是體內(nèi)藥物分析的重點及難點，因此有必要找到合適且便捷的前處理方法為藥物的測定創(chuàng)造良好的條件。水解是小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物前處理的一個重要環(huán)節(jié)，而酶水解是最為常用的一種水解方法。在合適的條件下，紅外輻射法和超聲波法均能提高酶的活性從而加快酶解反應(yīng)的速率，縮短酶解反應(yīng)時間。其機制目前并未完全明確，仍需進一步的研究揭示。

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R917；R969.1

A

1001-0408（2017）27-3886-03

2017-05-19

2017-08-19）

（編輯：周 箐）

上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)重要薄弱學(xué)科建設(shè)計劃項目（No.2016ZB0305）

＊博士研究生。研究方向：藥物分析和藥動學(xué)。E-mail：lzchen2016@126.com

#通信作者：主任藥師，教授，博士。研究方向：兒科臨床藥理學(xué)。E-mail：zplifudan@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.40