李家軒，吳登龍，樂 威，章勁夫.同濟大學附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，上海 00065; .上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，上海 0005

ATM－/－小鼠Sertoli細胞對于雙鏈DNA損傷修復的初步研究

李家軒1，吳登龍1，樂 威1，章勁夫2
1.同濟大學附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，上海 200065; 2.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，上海 200051

目的研究ATM基因移除小鼠Sertoli細胞對于DNA雙鏈斷裂（DSB）損傷的修復作用。方法將30只4～5周齡C57小鼠隨機分為ATM敲除小鼠（n=15）和對照組（n=15），各組又分為無照射和0.1 Gy電離輻射45 min、2 h、48 h組，觀察處死后睪丸組織DAPI、γ-H2Ax免疫熒光染色情況。結果ATM－/－小鼠Sertoli細胞相對于ATM+/+小鼠生殖細胞對DSB損傷修復效率降低。結論ATM－/－小鼠Sertoli細胞對于DSB損傷修復效率下降。

Sertoli細胞；ATM；DNA雙鏈斷裂；DNA損傷

DNA損傷廣泛存在于細胞的各項生理活動中。根據(jù)損傷DNA鏈壯結構的不同，可分為DNA單鏈斷裂與DNA雙鏈斷裂（DSB）。其中，DNA雙鏈斷裂是一種更為嚴重的細胞DNA損傷[1]。細胞損傷主要通過非同源性末端接合（NHEJ）、同源性重組（HR）兩種途徑修復。共濟失調毛細血管擴張突變基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）主要作用于HR途徑[2]，是HR修復途徑上游的重要基因。Sertoli細胞位于睪丸精曲小管，屬于生精系統(tǒng)內部的支持細胞，以旁分泌的形式分泌多種因子，直接調控精原干細胞的自我更新、精母細胞的減數(shù)分裂，在生精過程中發(fā)揮重要調控作用[3]。目前發(fā)現(xiàn)，在DSB發(fā)生時，Sertoli細胞中可以檢測到ATM，但敲除ATM之后，Sertoli細胞仍可進行DSB修復[4]。ATM對于Sertoli細胞修復DSB損傷是否有影響目前尚不明確。本實驗利用電離輻射造成DSB損傷，通過細胞染色觀察ATM敲除C57小鼠的DSB及修復情況，旨在研究ATM蛋白在Sertoli細胞DSB損傷修復的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

動物：4～5周齡C57、ATM－/－雄性小鼠各15只（同濟大學干細胞研究中心提供）。熒光染色抗體：DAPI購自Santa cruz公司，γ-H2Ax購自Abcam公司。NIKON共聚焦顯微型，同濟大學干細胞研究中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 處理小鼠

將ATM（A組）與C57（C組）小鼠分別隨機分為5組（A0、A1、A2、A3、A4；C0、C1、C2、C3、C4），予0.1Gy照射后，將A1與C1、A2與C2、A3與C3、A4與C4按注射后45 min、2 h、24 h、48 h時間節(jié)點脫頸處死，取睪丸組織。

1.2.2 免疫熒光染色

睪丸組織脫水處理后，被固定于4%多聚甲醇中，包埋冰凍，以20μm厚度切割。冰凍切片予2%牛血清蛋白處理后，分別滴加或γ-H2Ax（1：500）一抗。后予DAPI染色。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每只小鼠隨機選取1000細胞，統(tǒng)計DAPI（+）γ-H2Ax（+）點，并行雙總體t檢驗（α=0.05）。數(shù)據(jù)處理軟件為IBM SPSS 19.0，圖像由GraphPad Prism 5繪制。

2 結果

如圖1、2，對照組、ATM－/－組均表現(xiàn)為r-H2Ax（+）；C57小鼠生殖細胞隨時間進行DSB修復。無低劑量X-ray照射時，ATM－/－小鼠Sertoli細胞DSB程度高于C57組（圖3）；照射后，ATM－/－小鼠和C57組Sertoli細胞γ-H2Ax Foci點均隨時間下降，但ATM－/－小鼠Sertoli細胞γ-H2Ax Foci點則較高（圖4，P＜0.05）。表明，ATM－/－小鼠組Sertoli細胞DSB修復效率低于正常C57組。

圖1 低劑量（0.1Gy）照射后A組小鼠睪丸γ-H2Ax表達（×400）Fig.1 Expression of γ-H2Ax in testis tissues in group A after low dose（0.1Gy）irradiation（×400）

3 討論

DNA損傷是細胞生理過程中的常見損傷，可由射線、化學試劑、細菌分泌物等多種因素引起。而DNA雙鏈斷裂（DSB）是DNA損傷中最為嚴重的情況[5]。機體對于DSB主要有兩種應答修復途徑：1）HR修復途徑：主要作用于細胞G2期，利用細胞內染色體兩兩對應的特性，用對應染色體DNA序列做模板來回復斷裂序列；2）NHEJ途徑：主要作用于細胞G1/S期，利用修復蛋白拉近斷裂末端，以DNA粘合酶來粘合斷裂帶。不同的細胞經(jīng)由不同的途徑進行修復，并產(chǎn)生不同的結局入修復、變異、周期停滯、凋亡等[6]。

圖2 低劑量X-ray照射后，C組小鼠睪丸γ-H2Ax表達（×400）Fig.2 Expression of γ-H2Ax in testis tissues in group C after low dose X-ray irradiation（×400）

圖3 無照射時ATM－/－小鼠Sertoli細胞內γ-H2Ax點情況Fig.3 γ-H2Ax foci in ATM－/－mice Sertoli cells without irradiation

圖4 照射后兩組小鼠γ-H2Ax Foci點Fig.4 γ-H2Ax foci in both groups after irradiation

γ-H2Ax是一種在DSB損傷應答早期即出現(xiàn)的信號蛋白。當DSB出現(xiàn)時，組蛋白H2出現(xiàn)于DNA斷端并被磷酸化成γ-H2Ax，并以此來召集ATM蛋白，激活響應的修復通路。因此，γ-H2Ax被廣泛用評估DSB損傷程度[7]。

Sertoli細胞位于睪丸精曲小管中，主要分泌GDNF、FGF2等因子，支持并調控精原干細胞。在維持生精微環(huán)境中起重要作用[8]。在DSB出現(xiàn)后，Sertoli細胞如何進行應答修復，目前機制尚不明確[9]。

ATM基因廣泛表達于全身各種細胞中，其編碼的ATM蛋白作用于HR修復途徑。以往研究發(fā)現(xiàn)，敲除ATM后，小鼠睪丸內即出現(xiàn)生精障礙和“唯支持細胞綜合征”（Sertoli cell-only syndrome）：曲精小管中精原干細胞消失，僅存在sertoli細胞[10]。本實驗使用ATM－/－小鼠，通過統(tǒng)計ATM－/－小鼠出現(xiàn)DSB后γ-H2Ax表達情況，驗證ATM在Sertoli細胞DSB應答中的作用。

在照射（0.1 Gy電離輻射）后急性期內（45 min），ATM－/－Sertoli細胞與C57小鼠生殖細胞均表達r-H2Ax。ATM－/－小鼠中γ-H2Ax的foci點數(shù)量和密度多于C57小鼠，提示ATM－/－基礎DSB嚴重，且受IR后修復效能降低。表明ATM是Sertoli細胞重要的DSB修復蛋白。隨時間延長，ATM－/－或C57小鼠睪丸γ-H2Ax的foci點均逐漸減少，但ATM－/－小鼠γ-H2Ax的foci點消除慢于C57小鼠生殖細胞。說明即使敲除ATM，Sertoli細胞仍能進行DSB修復，但修復已受到影響，即敲除ATM后Sertoli細胞DSB修復效率降低。這表明，Sertoli細胞DSB損傷修復主要依靠HR途徑；而最后的緩慢修復現(xiàn)象亦提示，NHEJ途徑可能參與Sertoli細胞DSB損傷修復，但不是主要途徑。ATM－/－小鼠Sertoli細胞出現(xiàn)DSB后，應答修復功能受損，DSB累積，功能受影響，干擾了生精微環(huán)境，甚至影響生精過程。這可能是生殖細胞缺失、減少的主要原因之一。

本實驗表明，ATM基因參與了Sertoli細胞的DSB應答；ATM缺失會造成Sertoli細胞DSB修復功能下降。而Sertoli細胞仍有其他DSB修復途徑。但Sertoli細胞DSB修復的具體通路如何，DSB損傷對Sertoli細胞分泌物（GDNF、FGF2）是否有影響，還需進行深入的研究。

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Repair of DNA double-strand break in ATM－/－mice Sertoli cells

LI Jiaxuan1，WU Denglong1，LE Wei1，ZHANG Jinfu2
1.Department of Urology，Tongji Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200065，China；2.Tongren Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200051，China

ObjectiveTo study the repair of DNA double-strand break（DSB）in ATM－/－ mice sertoli cells.MethodsThirty C57 mice aged 4 to 5 weeks were randomly divided into ATM－/－mice group（n=15）and control group（n=15），and each group was randomly subdivided into 0.1 Gy ionizing irradiation 0 min，45 min，2 hr and 48 hr groups. The immunofluorescence staining of DAPI and γ-H2Ax in testis tissues after sacrifice was examined.ResultsATM－/－mice sertoli cells had a lower efficiency in repair of DSB than ATM+/+mice germ cells.ConclusionThe efficiency of DSB repair in ATM－/－mice sertoli cells is decreased.

Sertoli cell；ATM；DNA double-strand break；DNA damage

R698+.2

A

2095-378X（2016）01-0012-04

10.3969/j.issn.2095-378X.2016.01.004

2015-12-30）

李家軒（1989—），男，碩士研究生，研究男科方向

吳登龍，電子郵箱：Wudenglong@163.com