林榮 林琳 賈興澤 高妍 張文 劉向紅 任莉

(1.冀中能源邢礦集團(tuán)總醫(yī)院心內(nèi)科 河北 邢臺 054000；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院影像科，遼寧 大連 116000 )

·實驗研究·

心肌缺血再灌注損傷后對線粒體功能的影響和能量代謝的變化研究

林榮1林琳2賈興澤1高妍1張文1劉向紅1任莉1

(1.冀中能源邢礦集團(tuán)總醫(yī)院心內(nèi)科 河北 邢臺 054000；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院影像科，遼寧 大連 116000 )

目的 探討心肌缺血再灌注損傷(I/R)后心肌細(xì)胞線粒體功能和能量代謝的影響。方法 將實驗大鼠分成正常對照組(A組)、單純?nèi)毖M(B組)、缺血再灌注損傷組(C組)，每組6只。大鼠脫頸椎處死建立離體心臟，成功制作心臟缺血模型、I/R模型，各組灌流結(jié)束后，取大鼠左心室全層心肌標(biāo)本，提取蛋白，監(jiān)測腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和細(xì)胞色素C(Cyt-c)；收集灌流后的液體，監(jiān)測心肌生化指標(biāo)。結(jié)果 與A組和B組比較，C組AMPK表達(dá)顯著降低，Cyt-c顯著升高； C組心肌CK、LDH、CK-MB呈高表達(dá)，與A組和B組分別相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 心肌缺血再灌注損傷后，心肌細(xì)胞線粒體損傷較缺血期更嚴(yán)重，心肌能量蛋白AMPK表達(dá)顯著降低，代謝減慢，代謝物質(zhì)堆積，心肌損傷生化指標(biāo)表達(dá)升高。

心肌缺血再灌注損傷； 線粒體功能； 能量代謝

心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion ,IR)是指心肌缺血后恢復(fù)血流，心肌細(xì)胞的代謝功能和結(jié)構(gòu)反而出現(xiàn)了較缺血前更重的現(xiàn)象[1]。線粒體存在于除哺乳動物成熟紅細(xì)胞以外的真核細(xì)胞中，是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所。為機(jī)體提供95%以上的能量，線粒體的功能異常與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，本研究旨在研究心肌缺血再灌注損傷后對心肌細(xì)胞線粒體功能的影響和能量代謝的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 成年雄性大鼠18只，400 g左右(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物室)，本實驗遵循國家動物實驗管理條例和實施細(xì)則，Langendorff 離體實驗灌流實驗系統(tǒng)，肌酸肌酶(CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸肌酶同工酶(CK-MB)所有試劑均由南京建成生物制品有限公司制造。AMPK、Cyt-c和其抗體均由美國(Cell Signaling Technology)公司出品。

1.2 實驗方法 (1)標(biāo)本模型制作，采用戊巴比妥鈉給雄性大鼠肌注，麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定，剖開前胸，迅速取出離體心臟放置于4 ℃ K-H緩沖液中，輕輕擠壓心臟，排空其中殘留的血液，行主動脈插管，絲線結(jié)扎，迅速固定于Langendorff 離體實驗灌流裝置中，用含95%O2和5%CO2K-H緩沖液，緩沖液溫度控制在37 ℃左右，pH值7.4，恒壓逆行灌流，灌流壓力為80 cm H2O壓力。A組持續(xù)灌流90 min；B組平穩(wěn)灌流30 min后，停灌30 min；C組持續(xù)灌流30 min，停灌30 min，然后再灌流30 min。(2)采用Western blot 印跡法，取灌流后大鼠左室全層心肌作標(biāo)本，分離提取目的蛋白，監(jiān)測AMPK、Cyt-c的蛋白表達(dá)。具體方法：將100 mg組織剪碎加入0.5 mL裂解液，用組織勻漿器粉碎組織；取組織勻漿液0.5 mL加1 mL的抽提試劑，充分混勻。加轉(zhuǎn)膜緩沖液1 000 g，4 ℃離心10 min，溶液分成上下兩層，當(dāng)中即為提取的蛋白膜，吸附上現(xiàn)兩層液體，室溫干燥沉淀10 min，然后用半轉(zhuǎn)干法進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)移，用一抗稀釋4 ℃孵育過液，加入酶標(biāo)二抗，用Western blot專用發(fā)光試劑A液、B液以1∶1混合液，滴在膜上與之結(jié)合3 min,放入凝膠呈像系統(tǒng)曝光。利用凝膠呈像系統(tǒng)圖像分析軟件分析蛋白條帶的光密度值。

1.3 心肌生化指標(biāo)監(jiān)測 分別采集各組冠狀動脈流出液，按照試劑說明書，監(jiān)測CK、LDH、CK-MB的生物活性。

2 結(jié) 果

2.1 三組灌流液AMPK、Cyt-c的蛋白表達(dá) 與A組和B組比較，C組AMPK表達(dá)顯著降低，三組呈遞減形式；表明心肌缺血再灌注后導(dǎo)致AMPK表達(dá)下降；而Cyt-c蛋白表達(dá)顯著升高，三組呈遞增態(tài)勢。表明Cyt-c釋放增多，線粒體功能下降，細(xì)胞凋亡加速，見圖1、2。

圖1 AMPK蛋白表達(dá) 圖2 Cyt-c 蛋白表達(dá)

2.2 三組灌流液生化指標(biāo)監(jiān)測比較 與A組和B組相比，C組心肌生化指標(biāo)CK、LDH、CK-MB顯著升高，與2組分別相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；提示心肌缺血再灌注組細(xì)胞的損害更嚴(yán)重，見表2.

表1 心肌細(xì)胞損傷生化指標(biāo)比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，△P<0.05。

3 討 論

心肌梗死后及時進(jìn)行溶栓或介入治療是保證血液供應(yīng)再恢復(fù)的治療措施，但對灌注后的心肌細(xì)胞再損傷，一直是臨床上研究的熱點(diǎn)。當(dāng)心肌發(fā)生缺血缺氧時，心肌細(xì)胞線粒體的Ca2+超載、活性氧的大量釋放、線粒體膜通道開放等導(dǎo)致線粒體功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞，是心肌細(xì)胞再灌注損傷的主要原因[2]。心肌細(xì)胞擁有最大的線粒體密度，約占其細(xì)胞體積的45%，對調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡和能量代謝起著重要的作用[3]。線粒體與再灌注損傷的關(guān)系，可分為3個階段。心肌缺血初期:組織細(xì)胞缺氧，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化的水平下降，細(xì)胞內(nèi)磷酸肌酸很快耗竭并釋放出大量無機(jī)磷，促進(jìn)了糖酵解和乳酸生成，細(xì)胞內(nèi)pH值下降，細(xì)胞酸中毒。缺血延長期：隨著缺血時間的延長，線粒體功能與結(jié)構(gòu)損害，ATP的產(chǎn)生減少利用卻增加。線粒體呼吸鏈中Cyt-c 增高，打斷電子傳遞鏈，促進(jìn)氧自由基的形成，使細(xì)胞缺少ATP而死亡。再灌注期：大量氧自由基生成，Ca2+超載，MPT發(fā)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。

AMPK是一種高度保守的絲氨酸，廣泛存在于細(xì)胞中，參與機(jī)體多種代謝反應(yīng)，被譽(yù)為真核細(xì)胞的“代謝感受器”，是調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡的總開關(guān)[5]。當(dāng)機(jī)體受到任何能引起ATP生成減少與消耗增加的應(yīng)激刺激的初期，AMPK被激活，參與糖酵解，維持細(xì)胞能量供應(yīng)。它不但能調(diào)節(jié)糖、脂的代謝，增加糖的利用，降低膽固醇和脂肪的合成，降低細(xì)胞內(nèi)甘油三脂的含量，從而減緩了IR的發(fā)生，同時還能提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的防御能力。隨著IR損傷的繼續(xù)加重，大量心肌細(xì)胞壞死，無氧代謝物聚積，AMPK被大量消耗殆盡，導(dǎo)致在IR蛋白測試中低表達(dá)。本實驗結(jié)果，IR組與缺血組和正常對照組相比，AMPK呈遞減狀態(tài)，說明IR后導(dǎo)致AMPK的蛋白表達(dá)功能降低。Cyt-c 具有雙重功能，除參與電子傳遞外，在細(xì)胞凋亡的啟動中，Cyt-c 作為細(xì)胞凋亡的起始因子，起著非常重要的作用。大量的細(xì)胞凋亡又促使了Cyt-c 的釋放，進(jìn)一步加速了心肌細(xì)胞的凋亡。本組實驗中IR組，與正常對照組和缺血組相比，Cyt-c 在血液中高表達(dá)，三組呈遞增狀態(tài)，說明Cyt-c 的升高與心肌細(xì)胞的損傷程度呈正相關(guān)[6-7]。心肌細(xì)胞內(nèi)LDH、CK等在細(xì)胞膜完整的情況下，不能滲出細(xì)胞膜進(jìn)入循環(huán)，當(dāng)心肌細(xì)胞出現(xiàn)缺血缺氧時，細(xì)胞膜通透性增加，才能釋放入血，缺血再灌注損傷后，心肌出現(xiàn)變性、壞死，LDH、CK等外滲，血清中CK-MB的定量測量常被用作心肌損害的輔助診斷，因此，CK-MB水平升高常常與急性心肌梗死細(xì)胞死亡和損傷相關(guān)聯(lián)[8]。

本實驗結(jié)果得知，IR組LDH、CK、CK-MB顯著升高，與缺血組、正常對照組分別相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示心肌再灌注后心肌細(xì)胞沒有因為供血的恢復(fù)而減少心肌細(xì)胞的損害，反而加重了功能的損害。保護(hù)線粒體功能是延緩和減少心肌細(xì)胞損害的關(guān)鍵，這與趙艷艷，徐盟等[9-10]的研究相一致，在再灌注后期運(yùn)用抗凋亡和抗炎物質(zhì)，保護(hù)線粒體的功能，從而減少對心肌的損害程度，可為臨床治療提供幫助。

[1] 劉軍峰，賈克剛，鄭大勇，等.心肌缺血再灌注損傷實驗指標(biāo)的研究現(xiàn)狀[J].中國老年學(xué)雜志，2010，30(23)：3607-3609.

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[3] 余福林.缺血/再灌注損傷后心肌細(xì)胞線粒體功能及其能量代謝變化[D].延安大學(xué)，2011.

[4] 李妮妮.缺血后處理和ATP后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[D].青島大學(xué)，2010.

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[6] 呂磊，徐軍.心肌缺血再灌注損傷中線粒體保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報，2015，34(1)：131-134.

[7] 余福林，李紅梅，高延，等.缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞線粒體功能及其能量代謝變化[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(2)：113-115.

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