李海燕 張歡歡 楊彥平 李榮榮

(陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院老年科，陜西 咸陽 712000)

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1基因多態(tài)性與糖尿病相關(guān)性研究

李海燕 張歡歡 楊彥平 李榮榮

(陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院老年科，陜西 咸陽 712000)

目的 探討谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1基因(GSTM1)多態(tài)性與糖尿病的相關(guān)性。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法對正常健康對照組(n=110)與糖尿病組(n=112)GSTM1基因型進(jìn)行檢測。結(jié)果 糖尿病組GSTM1缺失率(72.32%)明顯高于正常對照組(35.45%)，兩者差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 GSTM1基因多態(tài)性與糖尿病存在相關(guān)性，GSTM1基因缺失型可能是糖尿病高危易感因素。

糖尿?。?谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1基因； 遺傳多態(tài)性

GSTM1基因位于染色體1p13.3，其包括缺失型GSTM1-0以及無意義突變型GSTM1-a和GSTM1-b[1]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為在糖尿病、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病病理發(fā)展過程中起著重要的作用[2]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶為機(jī)體內(nèi)最重要的抗氧化損傷的系統(tǒng)，GST基因的多態(tài)性可能會降低酶的抗氧化活性，從而易患糖尿病[3]。然而，目前罕有對GST基因多態(tài)性與中國人群糖尿病患者相關(guān)性的研究報道。本研究旨在初步探討咸陽地區(qū)糖尿病患者與GSTM1基因多態(tài)性相關(guān)性,報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 糖尿病組：選擇2013年1月至2015年3月來我院就診的Ⅱ型糖尿病患者112例，男性61例，女性51例，所有患者均無心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎功能不全及高血壓病史。平均年齡(47 ± 10.21)歲。對照組：來自正常健康志愿者110名，男性53名，女性47名，平均年齡(48 ± 9.07)歲，所有對照組均無動脈粥樣硬化、腫瘤、糖尿病及高血壓病史。對照組及糖尿病組在年齡及體質(zhì)量指數(shù)相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑及儀器 全血基因組提取試劑盒購自美國Axygen biosciences公司；2×PCR Mixture 購自立陶宛MBI公司；Biomltra梯度PCR儀為德國Sigma公司產(chǎn)品；WD29403c型紫外透視儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計和合成 根據(jù)GSTM1基因序列，采用prime5軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物：P1 5’-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3’，P2 5’-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度215 bp；并以β-actin為內(nèi)參照。引物序列為：P1 5’-ACT CCC CAT CCC AAG ACC-3’, P2 5’-CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3’, 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為400 bp，引物由上海生物工程公司合成。

1.4 外周血標(biāo)本采集和基因組DNA提取 采取所有研究對象外周靜脈血3 mL，并以乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)作為抗凝劑，放置于-20 ℃低溫冰箱備用。基因組DNA提取按照外周血微量基因組DNA提取試劑盒說明書操作，所提取DNA放置于-20 ℃低溫冰箱備用。

1.5 GSTM1基因型PCR擴(kuò)增 采用Biomltra梯度PCR儀對所有DNA標(biāo)本進(jìn)行GSTM1基因型檢測。反應(yīng)體系為25μL(2×PCR Mixture 12.5μL，雙蒸水8.5μL，各引物量為0.5μL，濃度1.0μmol/L，DNA模板2μL，濃度為100μg/μL)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.6 電泳檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，WD29403c型紫外透視儀觀察結(jié)果后照相。GSTM1基因型檢測結(jié)果以能擴(kuò)增出215 bp片斷為GSTM1(+)，否則為GSTM1(-)，并可見擴(kuò)增產(chǎn)物為400 bp的β-actin，所有樣本均重復(fù)3次PCR擴(kuò)增及電泳檢測。

2 結(jié) 果

2.1 GSTM1基因型檢測結(jié)果 正常對照組，GSTM1基因缺失型樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳只能見400 bp β-actin產(chǎn)物；糖尿病組可見215 bp GSTM1基因擴(kuò)增產(chǎn)物及400 bp β-actin產(chǎn)物。見圖1。

注：M 50bp Marker；泳道1, 3, 4, 6 為GSTM1(-)；泳道2, 5 為GSTM1 (+)圖1 GSTM1基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

2.2 GSTM1基因型在正常對照組及糖尿病組的分布 采用Hardy-Weinberg(HWE)方法對GSTM1基因多態(tài)性分布進(jìn)行遺傳平衡檢驗后發(fā)現(xiàn)P均>0.05，符合遺傳平衡定律。GSTM1基因缺失型在糖尿病組檢出率(72.32%)高于對照組檢出率(35.45%)(P<0.001)。見表1。

表1 正常對照組與糖尿病組GSTM1基因型

注：與對照組相比較，*χ2=30.371，P<0.01。

2.3 GSTM1基因型與糖尿病相關(guān)性

經(jīng)GSTM1基因缺失型與糖尿病相關(guān)性統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，GSTM1基因缺失型糖尿病患者較對照組相比較OR值為4.757，P<0.01。表明GSTM1基因缺失型可能是糖尿病高危易感因素。見表2。

表2 GSTM1(-)基因型與糖尿病相關(guān)性

3 討 論

糖尿病的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體內(nèi)活性氧水平增加及抗氧化能力減弱有密切的相關(guān)性，研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是糖尿病發(fā)生發(fā)展過程及其并發(fā)癥出現(xiàn)的重要病理因子之一[4]，還有研究認(rèn)為機(jī)體抗氧化能力減弱者易患糖尿病[5]。

GST超家族酶被認(rèn)為能通過與氧化物質(zhì)底物結(jié)合從而可以保護(hù)細(xì)胞免于氧化損傷[6]。GST基因多態(tài)性與多種疾病存在相關(guān)性，然而其與糖尿病的相關(guān)性研究甚少。H.Fujita等[7]對日本人群Ⅱ型糖尿病患者中患有糖尿病腎病和未患有糖尿病腎病患者的GSTM1基因多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)GSTM1基因缺失型在糖尿病合并糖尿病腎病及未合并糖尿病腎病患者中的發(fā)生頻率分別為48.6%和55.1%，其認(rèn)為GSTM1基因多態(tài)性與糖尿病腎病的發(fā)生無相關(guān)性。在我們此次研究中發(fā)現(xiàn)，GSTM1基因缺失型在對照組中的發(fā)生頻率為35.45%，而在糖尿病患者中的發(fā)生頻率高達(dá)72.23%，其基因分布差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義；OR值為4.757，表明GSTM1基因缺失型為糖尿病發(fā)生的高危易感因素。

本研究初步探討了中國咸陽地區(qū)的糖尿病患者與GSTM1基因多態(tài)性的相關(guān)性，結(jié)果顯示GSTM1基因缺失型為該地區(qū)糖尿病的高危易感因素。然而，本研究存在一定的局限性，包括樣本量不夠大，且只局限于陜西咸陽地區(qū)的糖尿病患者，有待于大樣本、多地區(qū)、多中心的進(jìn)一步研究。

[1] 唐開發(fā), 邢俊平, 孫發(fā). 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與男性不育[J]. 中華男科學(xué)雜志, 2013(03):266-269.

[2] Lyons T J. Oxidized low density lipoproteins: a role in the pathogenesis of atherosclerosis in diabetes[J]. Diabet Med, 1991, 8(5):411-419.

[3] Raza S, Abbas S, Ahmad A, et al. Association of Glutathione-S-Transferase (GSTM1 and GSTT1) and FTO Gene Polymorphisms with Type 2 Diabetes Mellitus Cases in Northern India[J]. Balkan J Med Genet, 2014, 17(1):47-54.

[4] Shinde S N, Dhadke V N, Suryakar A N. Evaluation of Oxidative Stress in Type 2 Diabetes Mellitus and Follow-up Along with Vitamin E Supplementation [J]. Indian J Clin Biochem, 2011, 26(1):74-77.

[5] Baynes J W, Thorpe S R. Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm [J]. Diabetes, 1999, 48(1):1-9.

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[7] Fujita H, Narita T, Meguro H, et al. No association of glutathione S-transferase M1 gene polymorphism with diabetic nephropathy in Japanese type 2 diabetic patients [J]. Ren Fail, 2000, 22(4):479-486.

Correlation study on the glutathione S-transferase M1 gene polymorphisms in patients with diabetes mellitus

LiHaiyan,ZhangHuanhuan,YangYanping,LiRongrong

DepartmentofGeriatricMedicine,theNo. 215HospitalofShaanxiNuclearIndustry,Xianyang712000,Sanxi,China

Objective To investigate the association of glutathione S-transferase M1 (GSTM1) gene polymorphism in patients with diabetes mellitus. Methods The GSTM1 genotypes were identified by multiplex polymerase chain reaction (PCR) with peripheral blood DNA samples from patients or controls. Results The frequencies of null GSTM1 genotypes in the patients with diabetes mellitus and controls were 72.32% and 35.45%, respectively. There were statistical significantly differences of frequencies of null GSTM1 genotypes between the cases group with control group (P<0.01). Conclusion The null alleles of GSTM1 may be a strong predisposing risk factor for diabetes mellitus.

Diabetes mellitus； Glutathione S-transferase M1 gene; Polymorphisms

陜西省科學(xué)計劃項目(2012K15-02)

R587.1；R313

A

1000-744X(2016)06-0567-02

2016-04-08)