褚冰 丁敏 易瓊△

(1.眉山市計(jì)劃生育藥品器械管理站；2.眉山市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 眉山 620010)

·論 著·

抗 EGFR單克隆抗體偶聯(lián)載紫杉醇納米粒對(duì)胃癌腫瘤靶向性能力研究

褚冰1丁敏2易瓊2△

(1.眉山市計(jì)劃生育藥品器械管理站；2.眉山市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 眉山 620010)

目的 為了增強(qiáng)載藥納米粒靶向腫瘤的能力，將載藥納米粒與抗上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)受體(EGFR)單克隆抗體偶聯(lián)，探究該偶聯(lián)是否會(huì)增加胃癌腫瘤靶向性。方法 將制備好的載藥納米粒在羥基膠乳微球偶聯(lián)抗體(EDC)的作用下通過(guò)酰胺反應(yīng)與抗EGFR單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制備成載藥免疫納米粒。通過(guò)透析袋法測(cè)定納米粒體外緩釋效果，用ELISA法測(cè)定抗體與載藥納米粒偶聯(lián)率，最后采用熒光標(biāo)記法對(duì)胃癌模型鼠進(jìn)行活體成像 結(jié)果 納米粒表面光滑，分布均勻，粒徑在200～300 nm間，載藥量為61.02%，并且具有緩慢釋藥的效果，抗體與載藥納米粒的偶聯(lián)率達(dá)到了70%，最終熒光活體成像的結(jié)果顯示，此免疫載藥抗體具有靶向胃腫瘤的效果。結(jié)論 我們制備的免疫納米粒既可以緩釋藥物也存在一定腫瘤靶向性，所以將抗體與載藥納米粒偶聯(lián)，可以增加腫瘤病灶處局部的藥物濃度，以此來(lái)緩解抗腫瘤藥物對(duì)人體其他正常組織毒副作用。

紫杉醇； 腫瘤靶向性； 免疫納米粒； 抗EGFR單克隆抗體

納米粒療法近年來(lái)在癌癥治療領(lǐng)域備受關(guān)注[1]，納米粒包裹藥物后可以優(yōu)化藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及藥效學(xué)性質(zhì)，通過(guò)控制藥物的釋放，減少給藥次數(shù)和劑量，從而增強(qiáng)藥物在體內(nèi)的傳遞，具有很強(qiáng)的生物活性。靶向載藥納米粒是在載藥納米粒的基礎(chǔ)上將載藥納米粒與配體或抗體偶聯(lián)結(jié)合，將藥物通過(guò)局部給藥的方式選擇性地富集趨向于特定的組織、器官或細(xì)胞中，即當(dāng)藥物到達(dá)病灶部位時(shí)才會(huì)發(fā)揮治療作用,從而減少藥物在其它部位的藥物濃度,最終降低藥物在全身各處的分布,提高藥物的生物利用度[2-6]。紫杉醇類藥物[7]被世界各國(guó)列為腫瘤治療首選藥物。EGFR[8]為表皮生長(zhǎng)因子受體，在腫瘤的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，抗EGFR的單克隆抗體是針對(duì)于胞外域中胃癌細(xì)胞表面EFGR的靶向性抗體,臨床數(shù)據(jù)表明此種抗體在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出了良好的抗胃癌腫瘤活性。本研究將紫杉醇與納米粒結(jié)合，制備成載藥納米粒，再將制備的載藥納米粒與抗EGFR的單抗偶聯(lián)，形成可以靶向胃癌腫瘤細(xì)胞的免疫載藥納米粒，旨在通過(guò)將該免疫載藥納米粒應(yīng)用于胃癌荷瘤小鼠的免疫治療，在體內(nèi)條件下進(jìn)一步驗(yàn)證該免疫納米粒靶向抗腫瘤活性，對(duì)癌癥靶向治療提供新思路。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料儀器 紫杉醇(上海源葉生物)，PLA(上海萬(wàn)疆生物)，抗EGFR單克隆抗體(美國(guó)基因公司)，荷瘤裸鼠，EDC碳化二亞胺(上海潤(rùn)成生物科技有限公司)，激光粒度儀(美國(guó)布魯克公司)，紫外分光光度計(jì)(上海箐華科技儀器有限公司)，NightOWL LB 983 小動(dòng)物活體成像儀(北京成志科為生物科技有限公司)。

1.2 研究方法 (1)載藥納米粒的制備[9]：以 0.1 mol/L pH 11的氫氧化鈉為溶劑,分別將紫杉醇溶液加入到已配制的內(nèi)水相W1(5 %明膠水溶液)及外水相W2(pH12含BSA的無(wú)菌水)中，將W1加入油相中，于超聲細(xì)胞粉碎儀中進(jìn)行破碎，形成初乳，再加入W2，將所得復(fù)乳于37°C、100 rpm/min條件下振蕩6 h,再用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)處理3 min ,重復(fù)超聲破碎多次直至得到均一的分散液。用0.22 的水相濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì),收集過(guò)濾所得液體,即為載紫杉醇納米粒溶液。冷凍干燥后即得黃色的納米粒凍干終產(chǎn)物。(2)載藥納米粒粒徑、表征及載藥量的測(cè)定：將載藥納米粒配制成濃度為5 mg/mL的樣品溶液，移取適量載藥納米粒，用激光散射粒徑分析儀測(cè)定其粒徑，并將納米粒溶液在4°C條件下12 000 r/min離心30 min,取上清液適量稀釋后用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)231 nm處測(cè)定吸光度(A)值,將測(cè)得值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算上清液中游離藥物含量。移取同濃度、同重的空載納米粒進(jìn)行上述相同處理，所得上清作為空白對(duì)照。根據(jù)下式計(jì)算納米微粒的載藥含量：載藥量(%)=(所加入紫杉醇含量-上清中紫杉醇含量)/載藥納米?？傎|(zhì)量×100%。(3)載藥納米粒體外釋放測(cè)定[10]：用PBS溶解10 mg已凍干的載藥納米粒，將其轉(zhuǎn)移到透析袋中，將透析袋放置在37℃水平恒溫振蕩器中含PBS的燒杯內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)透析(80 rpm/min),分別以0、0.1、0.16、0.30、0.50、1、2、4、6…96、120、130 h為取樣點(diǎn)，取出燒杯內(nèi)溶液5 mL，再補(bǔ)充5 mLPBS于燒杯內(nèi)，使總體積不變。于231 nm測(cè)定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線方程計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)載藥納米粒釋放紫杉醇的含量并繪制體外藥物釋放曲線。(4)載藥納米粒與抗體的吸附偶聯(lián):將載藥納米粒溶于pH =7.5的PBS溶液中配成濃度為15 mg/mL的溶液,將抗EGFR的單克隆抗體配成1.0 mg/mL的溶液,按50:1的質(zhì)量比將以上兩溶液進(jìn)行混合,向上述混合物中加入適量的EDC定容至最終反應(yīng)體系的濃度為1 mg/mL,在37°C溫和孵育5 h。將孵育后所得混合溶液在13 000 rpm下離心30 min,移去上清液(上清液中包含未偶聯(lián)抗體),所得偶聯(lián)免疫納米粒沉淀冷凍干燥,得到淡黃色的抗體偶聯(lián)載藥納米粒干燥終產(chǎn)物。并根據(jù)ELISA檢測(cè)納米粒上所偶聯(lián)的抗EGFR單克隆抗體含量。(5)體內(nèi)靶向試驗(yàn)：對(duì)胃癌模型裸鼠靜脈注射偶聯(lián)抗體的載藥納米粒，進(jìn)行熒光活體成像。

2 結(jié) 果

2.1 載藥納米粒粒徑、表征測(cè)定結(jié)果 納米粒粒徑為252.9 nm，在300 nm以下，載藥納米粒表面呈球形，光滑且分布均一，多聚分散系數(shù)在 0.3 以下，可重復(fù)性高。說(shuō)明該工藝制備納米粒體系成熟。見(jiàn)圖1。

圖1 載藥納米粒表征圖

2.2 載藥量測(cè)定結(jié)果 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線看出，y=0.0576x+0.0150(y為吸光度值，x為紫杉醇濃度)，在3.0 ～50 μg/mL的范圍內(nèi)，紫杉醇的濃度與吸光度值之間有良好的線性關(guān)系(R2=0.9889)由紫外-可見(jiàn)光光度法測(cè)定得到的載紫杉醇納米粒的載藥量為61.02%。見(jiàn)圖2。

圖2 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 紫杉醇體外釋藥規(guī)律 根據(jù)表1載藥納米粒緩釋數(shù)據(jù)繪制出累積釋藥曲線(圖3)，從圖中藥物體外釋放曲線可以看出，最初的24 h內(nèi)，藥物釋放率很快，屬于快速釋放期，藥物釋放率達(dá)到了78.28%，隨后，藥物釋放率上升緩慢直至130 h時(shí)，上升平緩且穩(wěn)定，最終測(cè)得的體外累計(jì)釋藥率的結(jié)果為 83.12%。見(jiàn)表1、圖3。

表1 載藥納米粒緩釋數(shù)據(jù)

圖3 載藥納米粒緩釋測(cè)定曲線

2.4 載藥納米粒上抗體偶聯(lián)含量 根據(jù)ELISA測(cè)定結(jié)果得出上清中抗EGFR單克隆抗體含量約為32.6 μg/mL，上清液體積為 9.8 mL，故上清中抗EGFR單克隆抗體含量約為 0.3 mg，由于總共加入了 1 mg 抗EGFR單克隆抗體，可推算得到納米粒所偶聯(lián)的抗體含量約為 0.7 mg，偶聯(lián)率達(dá)到了70%。

2.5 熒光活體成像 與抗EGFR單抗偶聯(lián)的載藥納米粒主動(dòng)靶向至腫瘤組織，在尾靜脈注射 4h 后就靶向到胃癌腫瘤組織，并且隨著藥物在體內(nèi)停留時(shí)間的增加，胃癌腫瘤部位的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，6 h后就僅胃癌細(xì)胞處有熒光而其他組織處的熒光強(qiáng)度微弱可忽略，由此說(shuō)明所合成的該種載藥納米粒具有靶向腫瘤組織的能力。見(jiàn)圖4。

圖4 載藥納米粒在裸鼠體內(nèi)熒光活體成像

3 討 論

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大醫(yī)學(xué)科學(xué)難題，根據(jù)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，近20年來(lái)，我國(guó)惡性腫瘤患者的發(fā)病率和死亡率逐年上升[11]，且年齡結(jié)構(gòu)也越來(lái)越年輕化，目前針對(duì)惡性腫瘤臨床上主要有三種療法，即手術(shù)切除、化療、放療，但這些方法往往會(huì)對(duì)人體正常組織細(xì)胞產(chǎn)生不可修復(fù)的損害[12]，同樣也會(huì)損傷人體免疫系統(tǒng)，因此研究開發(fā)高效治療腫瘤藥物已經(jīng)成為醫(yī)藥界關(guān)注的熱點(diǎn)。

納米制劑的研究是基于改變藥物在制劑中的存在狀態(tài)，使藥物表現(xiàn)出緩釋性，靶向性，高效性等生物學(xué)特性,為了使納米粒發(fā)揮更強(qiáng)的主動(dòng)靶向作用，使其帶著藥物定點(diǎn)靶向至特定器官，可采取將單抗與納米粒偶聯(lián)的方法，本研究采用非定向偶聯(lián)劑EDC進(jìn)行偶聯(lián)，交聯(lián)劑碳化二亞胺(EDC)[13-14]可在范德華力作用距離之內(nèi)的羧基與氨基之間形成化學(xué)交聯(lián)鍵，改善偶聯(lián)效率從而使得本實(shí)驗(yàn)中抗體的偶聯(lián)效率達(dá)到70%。之所以選擇EGFR是由于EGFR可穩(wěn)定地表達(dá)于許多上皮組織以及間質(zhì)中，不同器官發(fā)生的實(shí)體瘤也高表達(dá)EGFR,如卵巢癌、食管癌，胃癌等，EGFR在腫瘤中的高度表達(dá)及其在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化中起著重要作用的這些特點(diǎn),使EGFR成為具有良好前景的腫瘤治療靶點(diǎn)，目前胃癌的主要分子靶向藥物為抗EGFR單克隆抗體，部分臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示其對(duì)進(jìn)展期胃癌的病情控制具有一定的效果，因此將抗EGFR單抗與載藥納米粒偶聯(lián)，可以雙倍增加免疫納米粒的靶向性，我們通過(guò)熒光活體成像在不同時(shí)間段觀察到，小鼠體內(nèi)熒光先全身分布[15]，隨著給藥時(shí)間的增加，最終大量富集在胃部，并且小鼠體內(nèi)其他組織中熒光含量微弱。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，載有紫杉醇的免疫納米粒，主要靶向于胃部，在其他器官中含量甚少，大大降低了對(duì)全身正常細(xì)胞的傷害。

綜上所述，本研究所制備得到的免疫納米粒作為一種新型靶向腫瘤的藥物，具有一定開發(fā)前景，對(duì)靶向胃癌治療，增加局部藥物濃度以及聯(lián)合用藥有參考意義。

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Study on the targeting of EGFR monoclonal antibody coupled with paclitaxel loaded nanoparticles for gastric cancer

ZhuBing1,DingMin2,YiQiong2.

1.PlanningandManagementStationofMedicalEquipmentinMeishanCity,Meishan620010,Sichuan,China. 2.DepartmentofObstetricsandGynecology,MeishanCityTraditionalChineseHospital,Meishan620010,Sichuan,China.

Objective To explore this conjugation whether can improve the tumor-targeted ability in order to improve drug loaded nanoparticle's tumor targeted ability, conjugating the anti-EGFR monoclonal antibody and paclitaxel. Methods The method of couple linkage of amide interaction was used to prepare the immune nanoparticles, release of nanoparticles in vitro was tested by dialysis bag method, determination the coupling ratio by ELISA, at last, use fluorescence label imaging revealed the gastric cancer model rat. Results The nanoparticle that there was smooth surface, uniform distribution, the particle size in the range of 200 to 300nm, drug loaded rate reached 61.02%, the coupling ratio reached to 70%, and the fluorescence label image revealed the nanoparticles had ability of tumor targeted. Conclusion The result is shown that the immune nanoparicles has ability of tumor targeted. Therefore the conjugate the monoclonal antibody and drug loaded nanoparticle can improve the local drug concentration, reduce side effects of tumor drugs.

Paclitaxel； Tumor-targeting； Immune nanoparticles； Anti-EGFR monoclonal antibody

R735.2;R453

A

1000-744X(2016)06-0563-04

2016-04-10)

△通信作者，E-mail:164756619@qq.com